[发明专利]一种氧化型辅酶I的制备方法

权利要求书

1.一种氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD⁺；

其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.01-0.12mol/l的盐酸中浸泡0.5-2.5h后，加热至85-100℃，保温3-8min，加冰块冷却至室温，离心得到清液A；搅拌12-16h，搅拌过程中加入717^#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为15-25：80-400，酵母细胞和717^#树脂的重量比为15-25：45-90。

2.根据权利要求1所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.06-0.11mol/l的盐酸中浸泡0.7-2h后，加热至90-98℃，保温3-5min，加冰块以10-15℃/min的速度冷却至室温，以4000-6000rpm的速度进行离心10-20min得到清液A；搅拌13-15h，搅拌过程中加入717^#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为18-22：100-300，酵母细胞和717^#树脂的重量比为18-22：55-70。

3.根据权利要求1或2项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，提取NAD⁺包括如下步骤：酸化，交换，洗脱，去盐，分离，洗脱和收集。

4.根据权利要求1-3任一项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，提取NAD⁺的具体步骤如下：

S1、酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为1.95-2.05得到溶液C；

S2、交换：将S1中得到的溶液C以15-20ml/min的速度上122^#柱，上柱结束后，用蒸馏水以15-25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2-3；

S3、洗脱：调节液面距122^#柱上层树脂层4-5cm，用浓度为0.3-0.5mol/l的氨水以5-7ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7-8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2-3；

S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732^#树脂，边加边搅拌，至PH为4.95-5.05，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；

S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6.5-7.5，室温放置7-8天后，以3.5-5ml/min的速度上717^#树脂柱，上柱结束后，用40-60ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗涤；

S6、洗脱：取浓度为0.08-0.12mol/l氯化钾溶液50-70ml，以3.5-5ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以3.5-5ml/min的速度上769型炭柱，用20-40ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以0.5-1ml/min的速度洗脱NAD⁺，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成；

S7、收集：收集洗脱液，用5.7-6.3mol/l硝酸调节PH至2-3，立即加入以洗脱液体积份为基准的1-4倍的冷丙酮静置30-50min，去上清液，以2000-4000rpm的速度，离心2-5min，去上清液，干燥沉淀得到NAD⁺，其中冷丙酮的温度为-5至-15℃。

5.根据权利要求3或4项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S2中，将S1中得到的溶液C以18ml/min的速度上122^#柱，上柱结束后，用蒸馏水以20ml/min的速度洗涤，至流出液呈透明淡黄色。

6.根据权利要求3或4项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S6中，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2。

7.根据权利要求3或4项所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S7中，分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用5.7-6.3mol/l硝酸调节PH至2-3，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的2-3倍的冷丙酮静置35-45min，去上清液，以2500-3500rpm的速度，离心3-4min，去上清液，干燥得到NAD⁺，其中冷丙酮的温度为-10至-15℃。