[发明专利]一种氧化型辅酶I的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及辅酶I制备技术领域，尤其涉及一种氧化型辅酶I的制备方法。

背景技术

辅酶I(NAD)，化学名为烟酰胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸烟苷，在哺乳动物体内存在氧化型(NAD⁺)和还原型(NADH)两种状态，是人体氧化还原反应中重要的辅酶。参与各类细胞功能的新陈代谢，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内辅酶I浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的辅酶I浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。

辅酶I主要存在于酵母细胞线粒体中，属于胞内酶，且酵母细胞壁厚100-300nm,细胞壁由外及内分别有甘露聚糖层，蛋白质，葡聚糖层组成，其中占30-40％的葡聚糖是不溶性聚糖，构成细胞刚性骨架，保持细胞坚韧性和形态。胞内物质难以释放出胞外。想要获得高产量的NAD⁺，必须充分提高细胞破碎率，从而使得产物能够释放到细胞外，为后期提取创造条件。

目前，经常使用的破壁方法有温差法和高压均浆法，温差法(热处理法)主要通过水结冰与加热熔化产生的力以及温度突然变化，破坏细胞组织结构，该方法效果不理想；高压匀浆法需要高压均质机及大容量高速离心机，其破碎原理为细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎，该方法生产成本高，效率低，不适合工业化大生产。由上可知，两种方法均无法满足工业化大生产需要。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种氧化型辅酶I的制备方法，本发明能大大增加酵母细胞的破碎率，原料廉价易得，设备简单，操作方便，适合工业化生产。

本发明提出的一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD⁺；

其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.01-0.12mol/l的盐酸中浸泡0.5-2.5h后，加热至85-100℃，保温3-8min，加冰块冷却至室温，离心得到清液A；搅拌12-16h，搅拌过程中加入717^#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为15-25：80-400，酵母细胞和717^#树脂的重量比为15-25：45-90。

优选地，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.06-0.11mol/l的盐酸中浸泡0.7-2h后，加热至90-98℃，保温3-5min，加冰块以10-15℃/min的速度冷却至室温，以4000-6000rpm的速度进行离心10-20min得到清液A；搅拌13-15h，搅拌过程中加入717^#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为18-22：100-300，酵母细胞和717^#树脂的重量比为18-22：55-70。

优选地，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.1mol/l的盐酸中浸泡1h后，加热至95℃，保温4min，加冰块以13℃/min的速度冷却至室温，5000rpm的速度进行离心15min得到清液A；搅拌14h，搅拌过程中加入717^#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为20：120，酵母细胞和717^#树脂的重量比为20：60。

优选地，提取NAD⁺包括如下步骤：酸化，交换，洗脱，去盐，分离，洗脱和收集。

优选地，提取NAD⁺的具体步骤如下：

S1、酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为1.95-2.05得到溶液C；

S2、交换：将S1中得到的溶液C以15-20ml/min的速度上122^#柱，上柱结束后，用蒸馏水以15-25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2-3；

S3、洗脱：调节液面距122^#柱上层树脂层4-5cm，用浓度为0.3-0.5mol/l的氨水以5-7ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7-8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2-3；

S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732^#树脂，边加边搅拌，至PH为4.95-5.05，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；