[发明专利]表面活性剂包衣菌体催化合成共轭亚油酸异构体的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA) 是一组十八碳共轭二烯酸的统称，共轭双键有4种位置异构（8,10; 9,11; 10,12; 11,13）和4种几何异构（cis,cis; cis,trans; trans,cis; trans,trans），共有多达16种异构体，如：c9,t11-CLA和t10,c12-CLA异构体等。研究发现CLA具有抗癌、预防动脉粥样硬化、增强机体免疫力、抗糖尿病等生理功能，且越来越多的研究表明其生理活性具有异构体特异性，现在普遍认为c9,t11-CLA异构体具有抗癌和预防动脉粥样硬化的作用。在自然界中，CLA主要存在于反刍动物的奶和肉中的脂肪中，主要由c9,t11-CLA和少量t9,t11-CLA，t10,c11-CLA等异构体构成，但其含量通常都小于10mg/g脂肪，无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。

为实现CLA异构体的大量制备，人们已对微生物发酵制备CLA进行了较多研究。目前，微生物发酵均在水溶液中进行，由于所加的发酵底物—亚油酸是脂溶性物质，因此亚油酸加入发酵液前需经乳化处理，且添加量受到限制，从发酵液中获得CLA产物需经有机溶剂萃取，整个生产工艺存在发酵周期长、生产成本高、产量低的缺点。发明专利CN201110105610提出了一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法，底物添加量为25mg/mL，发酵时间长达120h，CLA的产量只有1.02mg/mL，底物的转化率只有4%。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种表面活性剂包衣菌体催化合成共轭亚油酸异构体的方法，显著缩短合成时间、提高产量和转化率、降低生产成本。

本发明包括以下步骤。

（1）菌体的透性化处理：收集处于对数生长期的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌体，按每克湿菌体重悬于5mL透性化处理液中计，将湿菌体重悬于透性化处理液中（所述的透性化处理液含体积百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100，20-200mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液），重悬菌体经37℃处理20min，离心收集透性化菌体。

（2）菌体包衣处理：透性化菌体用60mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克湿菌体重悬于20mL60mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将透性化湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，再向其中滴加表面活性剂溶液（所述的表面活性剂溶液为含质量百分比1%谷氨酸双油醇酯核糖醇的丙酮溶液），边加边混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体。

（3）催化合成：按每克冻干包衣菌体加入到500mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的亚油酸，在4-40℃下反应1-12h。

（4）产物收集：离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c9,t11-共轭亚油酸异构体。

本发明所述的步骤（1）中透性化处理液优选为含体积百分比1.0-2.0%的曲拉通X-100，30-100mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液。

本发明所述的步骤（2）中表面活性剂溶液的滴加量优选为每50mL菌悬液加入5-15mL表面活性剂溶液。

本发明所述的步骤（2）中处理温度优选为4-25℃。

本发明所述的步骤（2）中处理时间优选为3-5h。

本发明所述的步骤（3）中优选加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的亚油酸，在15-30℃下反应2-6h。

本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于催化合成c9,t11-共轭亚油酸异构体。