[发明专利]一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物代谢工程领域，具体地说，涉及一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)中的应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)分子式为C₅O₃NH₉，其分子量为131.13，熔点为118℃。5-ALA在农业上具有广泛的应用。研究表明它是无公害的天然物质，具有生物降解性，因此主要应用于绿色除草剂、植物生长调节剂、杀虫剂等方面。5-ALA作为一种无公害的新型农药，由于其在环境中易降解，无残留，对哺乳动物无毒性，因而受到越来越多的关注。另外，在医学领域，5-ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物，已经应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断与光动力治疗(PDT)中。

目前，5-ALA主要是通过化学方法合成的。其化学合成主要集中在以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺研究、以糠醛等杂环物质为原料的合成工艺研究及以乙酰丙酸或其衍生物为原料的合成工艺研究。但是化学合成具有工艺步骤多、分离提纯难、副产物多、5-ALA得率低等问题，从而造成生产成本高。除此之外，化学合成涉及很多有毒试剂，对环境也会造成污染。所以随着社会和科学技术的发展，以廉价的可再生资源为底物，利用微生物发酵生产5-ALA已是未来的趋势。目前市场上，葡萄糖价格为4500元/吨，5-ALA价格为80000000元/吨。所以以廉价的葡萄糖作为原料发酵产5-ALA，成本上具有极大的优势，并且还能减少对环境的污染，值得研发和推广。

国外的一些文献报道，通过诱变育种法对光合细菌球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)诱变，能够筛选出5-ALA高产菌株，利用其发酵生产5-氨基乙酰丙酸，5-ALA产量达到了7.2g/L。然而由于光合细菌发酵中采用光照，从而增加了成本，不适合大规模工业发酵生产。随着基因工程技术的成熟，人们已经采用基因重组技术将R.sphaeroides中的5-ALA合成酶基因(hemA)在野生型大肠杆菌中表达。Mariet和Zeikus获得大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株，5-ALA发酵产量达到了3.79g/L。Xie等人利用含有R.sphaeroides的5-ALA合成酶基因的重组大肠杆菌，经过发酵优化，5-ALA产量达到5.2g/L。2011年，Kang等人开始C5途径的研究，他们将来自于亚利桑那沙门氏菌(Salmonella arizonae)的hemA基因(编码glutamyl-tRNA reductase)突变后，与hemL基因(编码glutamate-1-semialdehyde aminotransferase)在E.coli中共表达，同时表达了一个由rhtA基因编码的5-ALA转运蛋白，使得5-ALA的产量达4.13g/L。在这些工艺研究中所使用的前提物质琥珀酸和甘氨酸主要是通过化学合成法制备，所以其生物转化5-ALA成本较高，同时由于高浓度的甘氨酸(＞1.7g/L)能够造成对菌体生长的抑制，使生物转化工艺相对复杂。另外，生物转化中所用的培养基为昂贵的LB培养基，这也成为5-ALA工业化的瓶颈。所以如何降低发酵成本及简化发酵工艺，成为5-ALA工业生产的关键问题。

同时，上述5-ALA生产方法主要采用的是模式菌株大肠杆菌，主要包括其C4-途径，即通过表达5-ALA合成酶生物转化琥珀酸和甘氨酸来生产5-ALA，或者是利用大肠杆菌的C5-途径，即表达外源的hemA和hemL基因以谷氨酸作为前提物质来生产5-ALA。既然5-ALA的C5-合成途径的前提物质是谷氨酸，要是采用能天然生产谷氨酸并且具有安全性的菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebaererium glutamicum)的话，则可无需过多的考虑如何提高上游代谢途径的谷氨酸产量的环节，这不仅能简化发酵工艺途径，还能大大降低发酵成本以及设备支出，使工业生产5-ALA的成本显著下降；另外，谷氨酸棒杆菌广泛应用于食品发酵，具有一定的安全性，利用谷氨酸棒杆菌发酵生产的5-ALA产品对进一步开发其医药价值具有积极的作用。然而，经检索，关于重组谷氨酸棒杆菌及其构建和其在生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)中的应用的专利及文献还未见报道。

发明内容

针对目前5-ALA生产中的缺陷，本发明要解决的问题是提供一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)中的应用。