[发明专利]一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法

说明书

本发明属于生物技术领域，提供了一种开发寡核苷酸探针染液涂染染色体的新方法。以普通小麦中国春和栽培黑麦荆州黑麦为例，利用基于重复序列开发的寡核苷酸探针，通过比较非变性原位杂交信号，确定最佳探针长度和浓度，按照信号强度进行不同探针配比并溶解到2×SSC中形成探针染液，将染色体制片在染液中直接进行染色，获得清晰稳定的中国春和荆州黑麦寡核苷酸涂染核型。方法具有简单快捷、一次可处理多张染色体制片、染液可重复利用的特点，利于提高原位杂交的自动化和商业化水平。同时公布了10个寡核苷酸探针序列和三种鸡尾酒探针染液，为小麦和黑麦染色体工程提供了新的方法，也为其他物种寡核苷酸染液的开发提供了范例。

技术领域

本发明属于动植物染色体遗传与生物技术领域，涉及一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法。

背景技术

染色体分带技术是二十世纪六十年代末建立起来的，现已成为追踪特定染色体(质)，识别染色体结构一种重要工具。Gill等(1991)(见参考文献：Gill B S，Friebe B，Endo T R.Standard karyotype and nomenclature system for description ofchromosome bands and structural aberration in wheat.Genome，1991，34：830-834)建立了基于小麦C-分带的标准带型，并广泛应用于鉴定外源染色体变异系(见参考文献：Jiang J，Gill BS.Sequential chromosome banding and in situ hybridizationanalysis.Genome，1993，36：792-795)。随着原位杂交技术的发展，人们发现物种专化性重复序列的质粒探针在植物染色体上产生清晰稳定的特征信号，比染色体分带更容易用于染色体识别和区分。Mukai等(1993)(见参考文献：Mukai Y B，Akahara Yumikon，YamamotoMaki.Simultaneous discrimination of the three genomes in hexaploid wheat bymulticolor fluorescence in situ hybridization using total genomic and highlyrepeated DNA probes.Genome，36：489-494)以重复序列pAsl和pSc119.2为探针的多色原位杂交识别了小麦21对中的17对染色体。基于GAA微卫星和pAs1成功的分辨了小麦所有染色体(见参考文献：Pedersen C，Langridge P.Identification of the entirechromosome complemem of bread wheat by two-color FISH.Genome，1997，40：589-593)。更有趣的是Cuadrado等(2009)(见参考文献：CuadradoGolczyk H，Jouve N.Anovel，simple and rapid nondenaturing FISH(ND-FISH)technique for the detectionof plant telomeres，potential used and possible target structuresdetected.Chromosome Res，2009，17：755-762)发现无需事先进行染色体变性，植物染色体端粒序列即可在染色体上产生信号，建立了非变性荧光原位杂交技术(ND-FISH)。在此基础上Cuadrado等(2010)(见参考文献：CuadradoJouve N.Chromosomal detection ofsimple sequence repeats(SSRs)using nondenaturing FISH(ND-FISH).Chromosoma，2010，119：495-503)又以SSR为探针，进行ND-FISH，发现多数序列均可产生几乎与变性FISH相同的杂交效果。