[发明专利]一种转基因小麦B73‑6‑1的品系特异性定量PCR检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒及应用，属于转基因作物检测技术领域。

背景技术

转基因小麦是利用基因工程技术，将外源基因导入小麦基因中，经过筛选得到的能够表达目的基因的小麦。转基因小麦B73-6-1是由基因枪将pHMW-1Dx5(携带高分子量麦谷蛋白亚基HMW-GS基因，由自身胚乳特异启动子驱动)和pAHC25(携带标记基因bar和GUS基因，上游连接广谱ubiquitin启动子)两个质粒通过共转化转入普通小麦品种中，经过筛选获得的表达外源基因HMW-GS、GUS和bar基因的纯合体转基因材料。目前，对于转基因小麦B73-6-1检测方法的研究仅限于定性检测，而不能够定量PCR检测，同时定性检测灵敏度不高，现有技术中缺少转基因小麦B73-6-1的定量PCR检测方法。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒，包括B73-6-1品系的特异性引物和探针以及内源参照基因的引物和探针；所述B73-6-1的品系特异性引物及探针是根据B73-6-1的5′端上游旁侧序列设计的；所述内源参照基因是根据GAG56D小麦醇溶蛋白基因设计的。

所述B73-6-1的5′端上游旁侧序列如SEQ ID NO.7所示。

所述B73-6-1的品系特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

所述内源参照基因的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

所述试剂盒在转基因小麦B73-6-1品系的定量检测中的应用。

优选地，所述应用，为利用核苷酸序列为SEQ ID NO.8-10所示的B73-6-1的品系特异性引物和探针以及SEQ ID NO.11-13所示的内源参照基因的引物和探针进行PCR反应，对转基因小麦B73-6-1进行特异性定量PCR检测。

优选地，所述PCR反应，条件为：预变性95℃30s；扩增95℃5s，60℃31s，40个循环。

优选地，所述PCR反应，每20μL定量扩增体系含有：待测样品DNA100ng，上游引物和下游引物各0.2μM，探针0.4μM，Taqman探针荧光染料1×，ROX参比染料1×，灭菌蒸馏水补足至20μL。

所述应用，具体步骤如下：

1)提取待测样品DNA；

2)以样品DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.8-10所示的B73-6-1的特异性引物和探针进行荧光定量PCR反应；以内部参照基因为模板，利用核苷酸序列SEQ ID NO.11-13所示的特异性内源参照基因的引物和探针进行荧光定量PCR反应；设置空白对照；所述PCR反应条件为：预变性95℃30s；扩增95℃5s，60℃31s，40个循环；所述PCR反应，每20μL定量扩增体系含有：待测样品DNA100ng，上游引物和下游引物各0.2μM，探针0.4μM，Taqman探针荧光染料1×，ROX参比染料1×，灭菌蒸馏水补足至20μL。

本发明有益效果：

本发明通过分析外源基因HMW-GS基因的旁侧序列，设计引物进行品系特异性定性和定量PCR检测方法的建立。本发明方法既能够定性，又能够定量，并且准确度好，灵敏度高，检测灵敏度可达0.01％，品系特异性好。

附图说明

图1为B73-6-1转基因小麦基因组用Pst I、Dra I、Pvu I和EcoR V酶切检测结果；

(1，DL2000DNA分子量标准；2，Pst I；3，Dra I；4，Pvu I；5，EcoR V)。

图2为B73-6-1转基因小麦中质粒pHMW-1Dx5在基因组上的整合图谱。

图3结果；

(M，DL2000DNA分子量标准；1，HMW-GS 5'上游旁侧序列扩增片段)。

图4 B73-6-1转基因小麦5'端上游旁侧序列Blast比对结果。

图5 B73-6-1品系特异性定量PCR产物位置图示；