[发明专利]一种黄霉素A组分的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种黄霉素A组方的分离纯化方法。

背景技术

黄霉素，又名默诺霉素(moenomycin)，是一种磷脂类抗生素，由斑伯氏链霉菌发酵所得。与大多数通过发酵法生产的天然抗生素类似，作为一种微生物次级代谢产物，黄霉素(以下简称为Mon)是一些结构类似物的统称。

中国专利CN1194984A公开了黄霉素A(以下简称为Mon A)及其铋盐组合物适用于控制幽门螺杆菌的感染，并以此治疗各种胃病如胃溃疡等。黄霉素这一新的治疗用途就对黄霉素A组分的分离纯化提出了要求。

英国专利GB1068639采用甲醇浸提→正丁醇萃取→沉淀→透析→正丁醇萃取→沉淀→硅酸镁柱层析脱色→凝胶过滤柱层析→阴离子交换色谱等方法，得到了黄霉素混合物的纯品。中国专利ZL 200510051382.1也采用甲醇浸提→正丁醇萃取→硅胶正相色谱→硅酸镁柱层析脱色→C8或C18反相色谱得到了黄霉素混合物的纯品，但是上述方法都未能制得黄霉素A组分的纯品。

目前，有关黄霉素A组分的分离纯化的文献少见，仅有以下报道：

美国专利US 3660569以硅酸镁脱色后的料液为基础，通过正相色谱(填料为硅胶)分离得到黄霉素A组分，洗脱剂为正丙醇与氨水的混合物。但是，由于正相硅胶填料不可重复使用，劳动强度大且溶剂消耗大等原因，并不适于推广使用。

孙承航等人(磷酸糖脂类抗生素moenomycin A的分离和鉴定,中国抗生素杂志，2003,28(6):325-327,360)在美国专利US 3660569正相色谱的基础上，采用填料粒径5μm的分析级C18色谱柱，得到了黄霉素A组分纯品，在文章的结尾作者也指出“以新的高效液相分离条件为基础的纯品制备方法，成本极高，仅用于毫克级的样品量的制备”。中国专利ZL 201210029457.6采用3mL C18固相小柱萃取、填料粒径5μm C18分析柱分离、C18固相萃取小柱进一步精制，所有试剂均为色谱纯及超纯水，最后得到淡黄色的Mon A。显然，该发明仅适用于实验室少量制备，难以工业化推广。

美国专利US 5986089也公开了一种黄霉素A组分的制备工艺(参见图4)。整个工艺流程大体可分为3步，第一步采用苯乙烯-二乙烯苯类大孔吸附树脂(MCI GEL CHP20P、DIAIONE HP20SS，日本三菱公司；Amberlite XAD16、Amberlite XAD1180s，美国罗门哈斯公司)预分离或超滤-溶剂萃取预分离，前者的除杂效果更佳；第二步为整个分离纯化工艺的关键，所用的分离模式为离子交换色谱，填料为聚甲基丙烯酸酯骨架、带有DEAE弱碱基团的阴离子色谱填料，之所以认为第二步是整个工艺的核心步骤是基于黄霉素A组分的纯度经该步得到最大的提升；第三步为反相色谱模式，其目的在于脱盐或进一步纯化得到黄霉素A组分的纯品。

美国专利US 5986089所公开的三步方法其实质是反相色谱—阴离子交换色谱—反相色谱的组合。根据色谱理论，存在如下不足之处：

首先，就整体而言，整个工艺衔接不合理。需要指出的是这不仅仅是美国专利US 5986089的问题，也是前述黄霉素或黄霉素A组分现有制备技术共同的问题。如上所述，DEAE阴离子交换色谱是美国专利US 5986089的核心，姑且不考虑成本的问题，直接用离子交换色谱纯化发酵液从理论上并不可行，其原因在于发酵液中存在的大量的阴离子会与带负电荷的黄霉素A组分竞争DEAE的位点，因此黄霉素A组分无法吸附在DEAE填料上，自然也无法达到分离纯化的目的。为了解决这一问题，申请人在阴离子交换色谱之前设置反相色谱过程，通过反相色谱脱盐、并达到初步纯化的目的。但反相色谱会引入有机溶剂，而离子交换色谱一般为水相上样，因此又不得不通过超滤和干燥脱除溶剂，再将干燥产物溶解在水中，这样才能满足阴离子交换色谱的条件。阴离子交换色谱的洗脱液中所含的黄霉素A组分色谱纯度已达到要求，但洗脱液中的盐分又必须除去，因此申请人又不得不后置反相色谱来脱盐。而在最后一步反相色谱之前，又对离子交换色谱的洗脱液进行超滤、干燥，干燥产物溶解在水中进行最后一步反相色谱操作(参见图5)。这就使得整个工艺复杂，有效成分收率降低而成本升高。