[发明专利]一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法

权利要求书

1.一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，包括以下步骤：

将待测DNA打断后连接上带有生物素的DNA接头，得到生物素标记的DNA片段；

将所述生物素标记的DNA片段分选成N个不同大小的DNA片段，其中，10≤N≤12，所述将待测DNA打断的步骤中，采用Tn5转座酶复合体将待测DNA打断并加上带有生物素修饰的DNA接头，且所述Tn5转座酶复合体和所述待测DNA的比例为3-5.5μL Tn5转座酶复合体：1μg待测基因组DNA；

将所述N个不同大小的DNA片段分别进行环化处理得到环状DNA；

然后清除未环化的线性DNA片段；

将所述环状DNA打断后连接上带有不同barcode的Truseq接头，得到含有不同Truseq barcode接头的DNA片段；

将所述带有Truseq barcode接头的DNA片段混合，并与链霉亲和素磁珠反应，富集带有生物素标记的DNA片段；

PCR扩增所述带有生物素标记的DNA片段并测序。

2.如权利要求1所述的一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，其特征在于，对所述生物素标记的DNA片段进行片段分选采用SAGE Science公司的SAGE ELF实现，具体方法为：

将生物素标记的DNA片段和加样缓冲液进行混合处理，将得到的混合样品加入到SageELF 0.75％琼脂糖凝胶DNA回收胶盒中，使用“时间”模式电泳200-260min，回收不同长度的DNA片段。

3.如权利要求1所述的一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，其特征在于，所述环化处理的方法为：

将所述N个不同大小的DNA片段、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液混合得到混合液，并使得所述混合液中所述T4 DNA连接酶的终浓度为0.10-0.30U/μL，所述DNA片段的终浓度为1.0-3.0ng/μL；

将所述混合液在16℃条件下反应1-17小时。

4.如权利要求1-3任一所述的一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，其特征在于，所述清除未环化的线性片段的方法为：

按下述比例配置得到反应体系：

将所述反应体系在37℃条件下反应30-90min后，70℃灭活酶蛋白30min。

5.如权利要求1所述的一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，其特征在于，将所述环状DNA打断为300-800bp大小的DNA片段。

6.如权利要求1-3任一所述的一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，其特征在于，在打断的DNA片段上连接具有不同序列的Truseq接头。