[发明专利]一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库(N-Size-Fragment Mate Pair Library,NSF-MP Library)的方法。

背景技术

大片段插入文库(Mate-paired library)在基因组研究中扮演着重要的角色，在基因组从头测序中，大片段插入文库可以为基因组的组装提供骨架，提高基因组组装的精确度和质量。目前完成的大的全基因组从头测序全是由几个不同大小插入片段(比如200bp，400bp)的小片段文库(shotgun library)和大片段文库(2kb，5kb，10kb和20kb)组成。利用小片段文库的read组装contig，然后利用大片段文库的read将contig组装成scaffold。此外，大片段插入文库还可以提高read在基因组重复区域的定位效率。在基因组重测序中，大片段插入文库可以用来高效的检测基因组结构变异。然而，由于技术和成本的限制，目前大片段插入测序文库在基因组测序的研究和应用上尚未被广泛利用。

目前，有多种方法可用于DNA大片段插入文库的构建。这些方法都建立在相同的思路之上。第一，将基因组DNA打断成不同长度的片段(一般为2-20kb)；第二，选择一定长度范围的DNA片段(比如3-5kb，9-11kb，15-20kb等)；第三，将选择的DNA片段环化连接，并在接合处引入带生物素修饰的碱基；第四，打断环状DNA分子，并用链霉亲和素磁珠(streptavidin bead)富集含有生物素的片段；第五，将富集出来的含有生物素的片段连接测序接头并测序。现有构建DNA大片段插入文库的方法，其区别主要在于环化方法的不同。Illimina公司生产的Mate Pair Library v2kit将打断的DNA直接通过末端修复(end repair)转化成平末端片段并在末端修复的过程中引入带生物素修饰的碱基，然后，被修复的DNA分子直接利用T4 DNA连接酶而环化。此方法的缺点是环化DNA分子的接合处无已知接头序列，因此测序后无法直接鉴定该read是mate-paired read还是shotgun read，给后续生物信息学分析带来很大不便。Life Technology公司生产的5500 SOLiD^TM Mate-Paired Library Kit(Catalog number:4464418)先将选择的DNA片段连接上一个带有粘性末端(stick end)的MP接头，然后再通过一个带有生物素的中间接头通过DNA退火杂交而将DNA分子两端的两个MP接头连接在一起成环。罗氏公司(Roche Diagnostics)的GS FLX Paired End DNA Library Preparation kit则先将选择的DNA片段两端连接上含有cre酶靶位点的接头，然后利用cre酶将DNA片段环化。Illumina生产的另外一种制备大片段文库的Nextera mate pair kit利用Tn5转座酶介导的转座特性，可以再打断基因组DNA的同时，将接头加在DNA上，然后，环化选择的DNA片段。这些方法共同的缺点在于，由于DNA片段选择这一步需要选择比较窄的范围的DNA，而目前的打断基因组DNA的方法都只能将基因组DNA打断成5-15kb的smear，因此，80％-90％的DNA在DNA片段选择这一步被浪费掉了，导致这些方法需要10μg以上的起始DNA材料才能满足要求。相比较而言，IlluminaNextera mate pair kit是目前最好的mate-paired测序文库构建的试剂盒。然而，由于其构建DNA大片段插入文库的过程中，利用切胶回收的方法选择回收一定范围(比如8-10kb)的DNA片段并利用T4 DNA连接酶将选择的DNA片段环化，因此，IlluminaNextera mate pair kit仍然未解决DNA大片段插入文库在DNA片段筛选步骤中大量DNA被浪费的缺点。此外，由于不同长度的插入片段在做基因组从头组装和检测基因组结构变异时的功能不同，在实际应用中，对同一份DNA样品常常需要构建数个不同插入长度的大片段文库，不仅增加了建库的成本，而且需求的DNA量也提高了，限制了大片段文库在基因组研究中的广泛应用。

发明内容