[发明专利]基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器

说明书

技术领域：

本发明涉及光电化学传感器领域，尤其涉及基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器。

背景技术：

激酶(PKA)调节的蛋白磷酸化在新陈代谢和细胞传导通路中起着重要的作用。蛋白激酶的过表达会引起多种疾病比如肿瘤、糖尿病、阿尔兹海默症等。在生物化学领域中，对激酶活性及其抑制剂的检测能够阐述信号传导的分子机制，在临床医学及载药领域，对早期发现激酶表达活性异常也有利于疾病的预防和治疗。

基于局域表面等离子体共振效应的光电生物传感器利用半导体金属氧化物(例如：氧化钛TiO₂、氧化锌ZnO)的性质将光信号转变成电信号用来检测激酶PKA活性，仪器简单、操作容易。由于TiO₂/ZnO为宽禁带氧化物，需要高能量紫外光才能激发，而紫外对生物分子的活性又有影响，因此不能直接应用于对生物分子的检测。

然而，现有的生物传感器中的工作电极主要为玻碳电极或金电极，其中，玻碳电极不能直接进行物理方法或者化学方法固载酶，只能通过在玻碳电极表面进行其他处理，例如化学交联或者溶胶凝胶使得玻碳电极表面固载少量酶。由于玻碳电极的固载酶量低，使得其灵敏度未能达到理想水平。而金电极通常只对含有或者修饰有特定基团比如巯基的酶进行固载，有一定的局限性。此外，玻碳电极及金电极在使用之前都要打磨抛光及活化处理，过程比较繁琐。因此，提供一种酶固载量高、分析灵敏度高且简单快速的工作电极具有重要的现实意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种基于贵金属纳米粒子局域表面等离子共振效应检测蛋白激酶活性的光电传感器。该方法具有很高的灵敏度和选择性，对酶的抑制性实验也表明，此方法达到了高效灵敏检测激酶PKA活性的目的。

当光线入射到贵金属纳米粒子(纳米金、纳米银、纳米钯或纳米铂)上时，如果入射光子频率与贵金属纳米颗粒自由电子的集体震荡频率相匹配，贵金属纳米粒子就会对光子能量产生强吸收作用，同时发生局域表面等离子体共振。在本发明中，将贵金属纳米粒子与一端为磷酸基团的DNA双链组成探针，肯普肽在蛋白激酶及ATP与金属镁离子的存在下，由于 蛋白激酶的催化，其丝氨酸上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生肯普肽磷酸化。由于金属锆离子对磷酸基团具有配位作用，含有磷酸基团的探针与磷酸化的肯普肽被锆离子连接到一起从而将贵金属纳米粒子进一步修饰到对应的金属氧化物半导体之上。在入射光下，当贵金属纳米粒子发生局域等离子体共振时，自由电子不断振荡到达光激发态。即使金属氧化物没有吸收任何光子，激发电子仍会被源源不断注入金属氧化物的导带之中，从而被氧化铟锡电极捕捉并记录光电流。本发明利用贵金属纳米粒子的局域表面等离子效应将金属氧化物的吸收范围扩大到可见光区，同时由于金属氧化物半导体本身对可见光无响应及性质稳定，因此又能够显著的降低背景信号，极大地提高了检测限，从而能够灵敏的检测PKA的活性。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器，包括工作电极、对电极、参比电极，所述工作电极包括ITO玻璃基底，在基底上依次制备有金属氧化物半导体层、在金属氧化物半导体层表面硅烷化和接枝戊二醛形成的立体网络结构层、固定化酶膜，DNA/纳米金属层。

优选的是，所述DNA/纳米金属层上镶嵌有光敏剂。探针中含有贵金属纳米粒子及光敏剂三联吡啶钌，在可见光的照射下，光敏剂三联吡啶钌捕获更多的光子，贵金属纳米粒子在光子的激发下发生局域表面等离子体共振效应，使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物(例如TiO₂/ZnO)导带上从而产生光电流。

一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器的工作电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)特异性DNA经杂交孵育后，再与贵金属纳米粒子偶联制得DNA/纳米金属溶胶；

2)在ITO玻璃片之上加半导体金属氧化物，高温干燥，即得半导体金属氧化物/ITO电极；

3)将半导体金属氧化物/ITO电极浸入有机硅烷化试剂进行硅烷化，反应完成后，再浸入戊二醛溶液中进行接枝共聚，得接枝戊二醛的半导体金属氧化物/ITO电极；

4)在黑暗条件下，在接枝戊二醛的半导体金属氧化物/ITO电极表面修饰多肽，脱除电极表面多余的液体后得多肽修饰的电极；

5)将含有生物酶和三磷酸腺苷的缓冲溶液滴加到多肽修饰的电极，使多肽发生磷酸化；并将步骤1)得到的DNA/纳米金属溶胶滴加到电极上，再用光敏剂对电极进行修饰，即得工作电极。