[发明专利]一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用有效
| 申请号： | 201510432148.7 | 申请日： | 2015-07-21 |
| 公开（公告）号： | CN105018365B | 公开（公告）日： | 2019-01-11 |
| 发明（设计）人： | 张娟;陈坚;李光磊;堵国成;方真 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N9/60;C12R1/84 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 张勇 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 角蛋白酶 重组毕赤酵母 宿主 基因工程领域 蛋白酶酶活 毕赤酵母 发酵培养 重组菌 干重 构建 外角 应用 细胞 | ||
1.一种重组毕赤酵母发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于，是将重组菌的种子培养液，按接种量12-13％接种到装液量25-30％的3L全自动发酵罐中，以50％氨水和磷酸溶液控制pH 5.5，温度30℃，调节搅拌转速为500rpm，通气量维持在2vvm；当甘油耗尽，开始以指数流加方式流加350mL的含12mL/L PTM1的50g/L的甘油，维持比生长速率在0.18h-1，并逐渐将搅拌转速调节到1000rpm，通气量调节到4vvm；待甘油再次耗尽，继续保持体系中基质匮乏状态1h且DO>60％后，开始流加100％甲醇诱导产酶，以反馈流加的方式维持培养基中的甲醇的体积浓度在1.8％；
所述重组菌为以毕赤酵母SMD1168为宿主，以pPIC9k为载体，表达了角蛋白酶；编码所述角蛋白酶的基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子培养液的获得是将重组菌株转接到YPD平板上，挑取单菌落接种到含有100mL的YPD培养基的1L摇瓶中，置于摇床中30℃，220rpm培养24h作为种子液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基为BSM培养基：5％磷酸26.7ml/L，K2SO4 18.2g/L，CaSO4 0.93g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM14.35mL/L。
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