[发明专利]一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用

说明书

本发明公开了一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用，属于基因工程领域。本发明以毕赤酵母SMD1168为宿主，以pPIC9k为载体，表达了角蛋白酶。本发明所构建的重组菌经发酵培养，168h时细胞干重达到174.1g/L，胞外角蛋白酶酶活达到1156U/mL，更适合工业化生产角蛋白酶。

技术领域

本发明涉及一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

我国每年在养殖业、畜牧业和纺织工业的生产过程中都产生数十万吨的羽毛、羊毛和动物角质等废物，这些废物的主要成分是角蛋白，由于其结构致密，因此很难被充分利用，大多数成为垃圾，不仅对环境造成污染，而且也是一种资源的浪费。

角蛋白酶能够特异性的降解角蛋白，且降解产物中含有动物生长所需要的必需氨基酸，所以可以利用角蛋白来降解羽毛、羊毛和动物角质等角蛋白废物，来生产动物饲料及有机肥料。然而，角蛋白酶来源的原始菌株通常对角蛋白酶的表达量很低，不能用于工业化生产，所以利用生物技术的方法构建一株高产角蛋白酶至关重要。

针对野生菌产酶效率低的问题，通常是将目的基因克隆到常用的表达载体中，然后利用已知的高效表达系统异源表达目的产物。但由于宿主菌的自身修饰，表达的产物酶活降低，且角蛋白酶对宿主菌本身有强烈的毒害作用，因此，产量一直很低，不能用于产业化生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题首先是提供一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母，是以毕赤酵母SMD1168为宿主，以pPIC9k为载体，表达了角蛋白酶。

所述角蛋白酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明要解决的第二个技术问题是应用所述重组毕赤酵母发酵生产角蛋白酶，是将重组菌的种子培养液，按接种量12-13％接种到装液量25-30％的3L全自动发酵罐中，以50％氨水和磷酸溶液控制pH 5.5，温度30℃，调节搅拌转速为500rpm，通气量维持在2vvm；当甘油耗尽，开始以指数流加方式流加350mL的含12mL/L PTM1的50g/L的甘油，维持比生长速率在0.18h^-1左右，并逐渐将搅拌转速调节到1000rpm，通气量调节到4vvm；待甘油再次耗尽，继续保持体系中基质匮乏状态约1h且DO>60％后，开始流加100％甲醇诱导培养基诱导产酶，以反馈流加的方式维持培养基中的甲醇浓度在1.8％(v/v)。

在本发明的一种实施方式红，种子液的获得是将重组菌株转接到YPD平板上，挑取单菌落接种到含有100mL的YPD培养基的1L摇瓶中，置于摇床中30℃，220rpm培养24h作为种子液。

在本发明的一种实施方式红，发酵培养基为BSM培养基：5％磷酸26.7ml/L，K₂SO₄18.2g/L，CaSO₄0.93g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM14.35mL/L。

本发明所构建的重组菌经发酵培养，168h时细胞干重达到174.1g/L，胞外角蛋白酶酶活达到1156U/mL，更适合工业化生产角蛋白酶。

附图说明

图1：重组质粒pPIC9k-kerD的结构图。

图2：重组菌株在3L发酵罐条件下，产角蛋白酶能力和生物量随时间的变化趋势。

具体实施方式