[发明专利]一种高效筛查G蛋白-偶联受体表达的融合基因构建方法

权利要求书

1.一种筛查G蛋白-偶联受体GPCR表达的融合基因构建方法，其特征在于该方法是：在G蛋白-偶联受体GPCR的前段插入人视紫红质Rhodopsin起始端的33个残基以及相应的蛋白酶切位点，在GPCR的末端插入His(5个残基)或者1D4(9个残基)抗原表位、相应的酶切位点，以及绿色荧光蛋白eGFP，构建Rho33-protease-GPCR-1D4-protease-eGFP；

对于低GC含量(含量≤60％)的GPCR用重叠延伸PCR方式构建，具体包括以下步骤：

1).利用PCR构建Rho33-protease-GPCR-1D4-protease-eGFP的三个片段：先分别PCR得到片段1：Rho33-protease、片段2：protease-GPCR-1D4-protease和片段3：protease-eGFP，电泳并胶回收三个片段；

2).利用重叠延伸PCR将三个片段连接在一起组成目的片段，即Rho33-protease-GPCR-1D4-protease-eGFP；

3).目的片段Rho33-protease-GPCR-1D4-protease-eGFP的前后两段分别具有HindIII和BamHI酶切位点，通过双酶切以及T4连接酶构建到表达载体pCDNA4上，转化入Top10感受态细胞，进行质粒扩增，抽提质粒并进行性测序验证；

4).基因测序正确后，将质粒瞬转进入HEK293细胞，通过荧光观察即可快速鉴定GPCR是否能够表达；

对于高GC含量(含量＞60％)的GPCR用一步基因克隆法方式构建，具体包括以下步骤：

1).利用PCR构建Rho33-protease-GPCR-1D4-protease-eGFP的前两个片段：先分别PCR得到片段1：Rho33-protease和片段2：protease-GPCR-1D4-protease，电泳并胶回收两个片段；

2).利用重叠延伸PCR将两个片段连接在一起组成目的片段，即得到目的基因的前半段Rho33-protease-GPCR-1D4-protease片段；

3).将载体质粒pCDNA3.1-eGFP用HindIII和KasI双酶切处理，得到线性化载体pCDNA3.1-eGFP，将重叠延伸得到的PCR片段与线性化载体片段按照等比例混合，利用一步法基因克隆试剂盒将PCR片段插入载体上；产物直接用于转化Top10感受态细胞，进行质粒扩增，抽提质粒并利用HindIII和BamHI双酶切和T4连接酶将目的片段重构到表达载体pCDNA4上，扩增质粒并进行测序；

4).基因测序正确后，将质粒瞬转进入HEK293细胞，通过荧光观察即可快速鉴定GPCR是否能够表达。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所构建的Rho33-protease-GPCR-1D4-protease-eGFP融合基因，其Rho33能够有效增强GPCR的插膜的效率，提高蛋白表达量；1D4能够为蛋白提供抗原表位便于纯化；eGFP能够为GPCR的快速鉴定及筛选提供有利条件；同时插入合适的酶切位点能够在纯化过程中去除Rho33和eGFP，保证蛋白的功能。