[发明专利]一种高效筛查G蛋白-偶联受体表达的融合基因构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子影像学和细胞生物学领域，具体包括一种新型G蛋白-偶联受体，GProtein-CoupledReceptor(GPCR)的融合基因的构建，在这种融合基因表达条件下有利于提高GPCR的产量和快速的筛查鉴定。

背景技术

GPCR是一类有七次跨膜结构的膜蛋白，也是最大的膜蛋白和细胞表面受体家族。GPCR在真核生物细胞中广泛分布，从酵母菌到人类细胞中都有发现，人体中有超过800种GPCR，响应范围包括：光、离子、气味分子、荷尔蒙、神经递质素和多肽等。GPCR几乎参与了人体的各种生理调节作用，其突变会造成各种疾病的发生，长期以来一直是生命科学和药物研发的热门领域和前沿方向。目前有大约一半的现代药物都是以GPCR为靶点，但是四分之一GPCR的配体都不明确，许多功能还不清楚，大量的蛋白结构尚未解析。截至2015年，PDB数据库仅有25个GPCR结构，仅占GPCR总数的3％(http：//gpcr.scripps.edu/)，这严重制约了GPCR功能的深入研究以及基于作用机制的药物研发。

尽管GPCR结构的研究对于药物研发十分重要，但是除了最先得到高分辨率蛋白结构的视紫红质(Rhodopsin)以外的GPCR的表达量都很低，是深入研究的一大阻力。例如，CX3CR1(chemokinereceptor1)和ADRB3(β3-AdrenergicReceptor)均为目前没有结构的GPCR，但是它们分别在艾滋病、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和慢性阻塞性肺炎、肥胖症、II型糖尿病等的致病过程中起着关键作用，结构信息的缺失导致了功能研究和药物开发的困难。

GPCR的低表达量是限制结构功能研究的主要因素，目前广泛应用的异源GPCR表达体系主要有：大肠杆菌表达体系、酵母细胞表达体系、昆虫细胞表达体系、哺乳动物细胞表达体系以及无细胞表达体系等几种。表1归纳了各种表达体系的主要优缺点，可以看出表达体系的选择对GPCR结构-功能研究及对应药物的开发至关重要。目前，用于生物技术领域及药物研发的表达体系主要有原核和真核表达系统两种。大肠杆菌表达体系为原核表达系统中最为广泛使用的体系，已经成功地表达出了多种GPCR，且具有表达水平高、操作简单、周期短、易于大规模高密度培养及成本低等优点，但其致命的弱点是无法实现GPCR翻译后的修饰，严重影响着GPCR生物活性的体现。鉴于以上原因，利用真核表达系统表达GPCR受到了越来越广泛的重视，而哺乳动物表达体系是目前真核表达系统中最能完备地制备出折叠正确并具备完全生物活性的GPCR表达体系。哺乳动物表达体系的优势在于，它具有正确的翻译后修饰功能(包含二硫键的正确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的实现等)以及拥有最接近真核动物细胞的细胞质环境和细胞膜磷脂组成，并且该体系下活性GPCR蛋白的比例较高。但是，哺乳动物细胞表达体系由于其表达过程的复杂性和条件的多样性，使得培养难度加大、要求更高。

尽管多种哺乳动物细胞表达体系的建立为天然环境下膜蛋白的表达纯化提供了一定的平台，但并不是所有的GPCR都能顺利表达，对原有的基因进行有效的改造是最好的提高蛋白表达产量的方法，包括添加基因表达操纵序列，或者添加蛋白稳定序列等方法。此外，蛋白表达与否，蛋白表达量的鉴定也需要建立行之有效，方便快捷的方法。WesternBlot检测是最常用的蛋白表达检测方法，但要经过细胞转染、收获，蛋白提取、电泳，转膜，封闭，一抗二抗孵育，显色等复杂的操作步骤，实验周期长、不稳定因素多，任何一个环节出错都会导致实验的失败，并且由于需要特异性的抗体，成本较高。此外，因为很多GPCR缺乏特异性的单克隆抗体或抗体的特异性不高，所以依赖于抗体检测的WesternBlot不具有通用性。因此传统的表达检测方法不能满足GPCR表达的快速检测的要求，给蛋白的进一步研究造成了不便。