[发明专利]亚热带森林土壤纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法，尤其涉及一种利用多功能酶标仪测定亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ活性的方法。

背景技术

纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一，在土壤有机物成分中，纤维素约占植物有机物的40%-55%，和木质素一起共占土壤有机物的60-75%。纤维素是D-葡萄糖以β-1，4 糖苷键组成的大分子多糖，在纤维素酶的作用下完成生物转化过程。纤维素酶是一类复合酶系，包括三类不同的互补酶：外切葡聚糖苷酶、内切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。其中，纤维二糖水解酶Ⅰ是重要的外切葡聚糖苷酶，能分解纤维素释放葡萄糖或纤维二糖，是水解天然纤维素必不可少的一类重要酶。准确检测土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ的活性有助于准确了解土壤中纤维素的分解能力，同时对于研究土壤其他功能酶系统及对土壤有机物分解过程的本质揭示具有重要意义，此外也为解开土壤养分循环机制提供理论依据。

目前，国内外对于纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定多针对微生物发酵的提取液上，而对亚热带森林土壤纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法未见报道。对于微生物发酵的提取液，纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法常见的有脱脂棉法、微晶纤维素法。脱脂棉法以脱脂棉为底物，加入稀释酶液以及醋酸钠缓冲液混合后，50℃条件下反应，然后加入3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，以每小时水解纤维素释放1μmol 葡萄糖所需要的酶量为一个酶活力单位。该方法以棉花为底物测试原酶液所产生的还原糖量作为该酶的活力,虽然无纤维二糖水解酶时棉花的水解程度很小,但还原糖的产生还取决于原酶液中内切葡聚糖苷酶、纤维二糖酶组分的量,因此该测定方法不能确切反映纤维二糖水解酶的活力。国外，采用微晶纤维素（商品名Avicel）为底物，以水解产生的还原糖量来计算酶活力。Avicel是用稀酸水解纤维材料使结晶区与非结晶区断裂后得到的聚合度降低、结晶度升高的产物,其中无定形区不会完全去除,聚合度一般为80-200, 微晶纤维素较棉纤维易被纤酶原酶液酶解, 内切葡聚糖苷酶组分对它的水解程度高于棉花,对原酶液而言该方法反映的是外切葡聚糖苷酶、内切葡聚糖苷酶和纤维二糖酶的协同作用结果,对单一组分来说,反映的实际上是某些内切葡聚糖苷酶组分活力。

因此，单一纤维素酶活性测定难的问题仍需解决。

发明内容

本发明解决的技术问题是如何快速准确测定亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ的活性，以及对活性测定时的反应底物、条件、反应装置等因素进行优化。在本发明中，以亚热带森林土壤为酶样品库，以对硝基苯纤维二糖苷为酶的特异底物，在纤维二糖水解酶Ⅰ的最适条件下，该酶可将对硝基苯纤维二糖苷酶解生成对硝基苯酚，反应溶液中加NaCO₃溶液以调节pH值使酶失活来终止酶活反应，以 1 g土样1 h内分解产生1μmol 对硝基苯酚所需的酶量作为一个酶活力单位。该测定方法选用了对硝基苯纤维二糖苷作为纤维二糖水解酶Ⅰ的特异底物，解决了单一纤维素酶活性测定难的问题，酶解反应在最适条件下进行，检测生成物时采用多功能酶标仪，提高了准确性，缩短了测定时间，节约了成本。同时，填补了森林土壤纤维二糖水解酶Ⅰ活性测定的空白。

为解决上述问题，本发明提供一种亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法，以对硝基苯纤维二糖苷为底物，称取土壤与底物水浴反应后，采用多功能酶标仪进行测定。

进一步的，本发明所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法由以下步骤组成：

（1）用40mM-60mM醋酸钠缓冲液将对硝基苯纤维二糖苷配制成浓度为1.0mM－1.5mM的底物溶液，所述醋酸钠缓冲液pH为4.5－5.0；优选为用50mM醋酸钠缓冲液将对硝基苯纤维二糖苷配制成浓度为1.2mM的底物溶液，所述醋酸钠缓冲液pH为5.0。

（2）吸取140μL－160μL步骤（1）制得的底物溶液于EP管中，称取0.04g-0.06g土壤加入其中，充分混匀后置于40℃－50℃恒温条件下水浴，反应60min-90min；反应结束后加入0.1mL 0.4M-0.5M NaCO₃溶液终止反应；优选为吸取160μL步骤（1）制得的底物溶液于EP管中，称取0.06g土壤加入其中，充分混匀后置于40℃恒温条件下水浴，反应90min；反应结束后加入0.1mL 0.5M NaCO₃溶液终止反应。