[发明专利]一种新型群体感应抑制剂的分离提取、结构鉴定及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物制药领域，具体涉及一种由海洋污泥来源的水莱茵海默氏菌QSI02（Rheinheimera aquimaris QSI02）的发酵培养、具有细菌群体感应抑制活性化合物的分离纯化、结构鉴定及其应用。

背景技术

传统的抗生素都是以细菌的细胞壁合成、蛋白质合成、叶酸合成、DNA的超螺旋等细菌的重要生命过程为靶点，直接杀死或者抑制微生物的生长来实现抗感染的目的，在这种生存压力下，细菌通过改变自身机制，很容易产生耐药性。解决细菌耐药性已成为人类面临的重大卫生挑战之一。近些年来研究发现，细菌群体感应（quorum sensing， QS）系统使作为单细胞生物的细菌，具备了部分类似于多细胞生物的功能，让细菌在应对环境挑战时，能协调一致，使细菌形成一种群体行为来有效的抵御外界环境压力、攻击宿主等。以细菌QS系统为靶标筛选的抗菌药物，与传统抗生素的作用机制完全不同，它不杀死细菌或抑制单个细菌的生长，只抑制细菌QS调控的致病行为，不易诱导耐药突变。

据统计，海洋微生物是天然活性物质的重要来源。海洋相对独特的高盐、高压、寡营养、低光照等复杂生态环境造就了海洋微生物独特的代谢机制，产生了众多的结构多样性和生物活性多样性的先导化合物。目前，已从海洋微生物中发现了大量的具有化学结构新颖、生物活性特异的化合物，其中有些已经作为药物广泛应用于临床。此外，海洋微生物资源丰富、易于培养，可通过人工发酵培养提供稳定的代谢产物，已成为一种重要的环境友好的微生物资源。

有关环（L-色氨酸-L-丝氨酸）化合物的文献报道较多，但是该化合物从水莱茵海默氏菌中分离得到未见有报道。本发明人研究得知，水莱茵海默氏菌QSI02（Rheinheimera aquimaris QSI02）（保藏编号为CCTCCNO:M2015245）液体发酵产物的甲醇提取物具有降低紫色杆菌紫色素产生的作用，进而对其化学成分进行了研究。研究发现所得化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸）在一定浓度范围内对紫色杆菌和铜绿假单胞菌都具有群体感应抑制活性，目前尚未见对该化合物的群体感应抑制活性的报道，因此市场上也尚未有与此相关的药物。

发明内容

本发明旨在提供一种由海洋污泥来源的水莱茵海默氏菌QSI02（Rheinheimera aquimaris QSI02）发酵提取物中分离纯化得到的具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应系统的活性化合物，该化合物在不抑制致病菌菌体生长的范围内能够显著的降低相关致病因子的表达，减弱致病菌的耐药性。

本发明所提供的活性化合物来源于海洋细菌水莱茵海默氏菌QSI02（Rheinheimera aquimaris QSI02），该菌株于2015年04月23日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015245；海洋污泥来源水莱茵海默氏菌QSI02经液体发酵、分离纯化得到具有细菌群体感应抑制活性的化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸），英文名称为：(3S,6S)-3-((1H-indol-3-yl)methyl)-6-(hydroxymethyl)piperazine-2,5-dione，分子式为C₁₄H₁₅N₃O₃，化学结构式如式。

本发明所述的活性化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸）的制备方法包括：海洋细菌水莱茵海默氏菌QSI02（Rheinheimera aquimaris QSI02）发酵培养与化合物的分离纯化两个步骤。将活化的菌种接种到海水培养基中进行摇床培养。发酵结束后，离心、真空低温浓缩至膏状，用甲醇浸提得甲醇提取物；将甲醇提取物用0.22 μm有机相滤膜过滤，采用紫外检测器（UV-900）与凝胶柱层析（Sephadex LH20）串联，以甲醇作为洗脱剂，分离为5个流份，对流份采用筛选模型进行活性检测，其中第4个活性洗脱流份再经过薄层层析制备，展开剂为水:正丁醇:乙酸乙酯=1:3:1，分离纯化得到具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应的单体化合物。