[发明专利]肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应用

权利要求书

1.一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒，其特征是，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201523。

2.如权利要求1所述的肠道病毒71型3CD嵌合病毒的拯救方法，其特征是，步骤如下：

(1)以SDLY1全长cDNA为PCR模板，引物1为上游引物，引物5为下游引物扩增SDLY1株的3CD；

(2)以SDLY107全长cDNA为PCR模板，引物6为上游引物，引物4为下游引物扩增SDLY107株的3’UTR片段；

(3)采用融合PCR方法，以引物1为上游引物，引物4为下游引物将两个片段连接起来得到融合片段3CD(1)-3’UTR(107)；

(4)将(3)中融合PCR产物3CD(1)-3’UTR(107)克隆连接入pMD19-T载体，形成pMD19-T-3CD(1)-3’UTR(107)；

(5)将pMD19-T-SDLY107质粒以及步骤(4)得到的pMD19-T-3CD(1)-3’UTR(107)分别进行HindIII和XbaI双酶切，回收酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组病毒质粒pMD19-T-107(1-3CD)；

(6)将步骤(5)得到的pMD19-T-107(1-3CD)进行扩增，并使用HindIII和XbaI双酶切，回收107(1-3CD)，体外转录后转染入RD细胞，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，传代培养直至细胞病变稳定即为肠道病毒71型3CD嵌合病毒。

3.如权利要求2所述的拯救方法，其特征是，所述步骤(5)、(6)中酶切的具体步骤如下：HindIII与XbaIFastDigestenzyme各2.5μL，质粒<2.5μg，10×FastDigestGreenBuffer5μL，水补齐至50μl，37℃酶切3-4h。

4.如权利要求1所述的肠道病毒71型3CD嵌合病毒在制备疫苗中的应用。

5.如权利要求1所述的肠道病毒71型3CD嵌合病毒在制备抗病毒药物中的应用。