[发明专利]肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应用。

背景技术

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒，并于1959年首次提出HFMD命名。早期发现的手足口病的病原体主要为CoxA16型，手足口病与EV71感染有关的报道开始于20世纪70年代初，1972年EV71首次在美国确认。此后EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。其多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情进展较快，导致死亡。重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起。

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71抗体在成人血清中的阳性率达到65％以上，说明了这种病毒的广泛传播，每年春夏季温度升高时都会进入感染高峰期，流行趋势从散发逐渐趋于有小型聚集性爆发。

手足口病的相关科研工作起步较晚，发达国家拥有较好的科研平台，亚太地区为主要流行区域，但对EV71的基础研究投入不够，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物，对EV71进行有效的预防和控制。由于肠道病毒71型属于小RNA病毒科，所以其基因组的人工操作较难，这给疫苗的制备增加了难度。

因此目前对EV71的疫苗研究仍主要聚焦在传统的灭活疫苗上，而此类疫苗的免疫效果一般较低；虽然能够诱导产生包括中和抗体在内的免疫反应，但不能诱导细胞毒T淋巴细胞反应；诱导产生的免疫反应持续时间较短，需要多次接种；需要使用佐剂，制剂中存在灭活剂，灭活剂对病毒抗原有影响；由于诱导的免疫反应水平较低，以及各个抗原成分之间的疫苗应答不平衡，可能诱发疾病；一般不能通过自然途径接种，不易产生局部免疫反应。由于以上问题的存在，亟需研发新型疫苗，既能保留完整的免疫原性，有效刺激免疫应答，又能避免感染性。此类疫苗的研制，需要对病毒基因组中各基因编码区域的功能进行深入研究和了解，这种深入了解还有助于筛选抗病毒药物的靶点研究。

反向遗传学方法研究RNA病毒，是在质粒水平上来操作、研究RNA病毒，获得的拯救病毒表型稳定，操作方便，为EV71的深入研究提供了一个很好的基础平台。但迄今还没有合适的病毒作为疫苗研究的工具。

现有技术中没有研究者做EV71拯救病毒的，主要是存在技术偏见EV71的反向遗传学研究是无法实现的，此外由于EV71拯救病毒是一种新的病毒，所以在研究拯救方法时就存在很大的不可预期性，如何克服这种不可预期性是现有技术中无法做到的。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒，拉丁文学名：(Humanenterovirus713CDchimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201523。

本发明病毒的形态特征描述：

该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的四种结构蛋白VP1～VP4构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。该病毒感染敏感细胞RD细胞后，形成的CPE特征为细胞变圆、固缩、折光性增强，然后脱落。

一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒的拯救方法，步骤如下：

(1)以SDLY1(GenBank，HM188481.1)全长cDNA为PCR模板，引物1(序列见表2，SEQIDNo.1)为上游引物，引物5(序列见表2，SEQIDNo.5)为下游引物扩增3CD蛋白编码区；

(2)以SDLY107(GenBank，JX244186.1)全长cDNA为PCR模板，引物6(序列见表2，SEQIDNo.6)为上游引物，引物4(序列见表2，SEQIDNo.4)为下游引物扩增3’UTR编码区；