[发明专利]一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备技术，特别涉及一种用P(MVE-alt-MAH)交联剂交联法制备得到的多个硬度梯度大孔改性蛋清细胞培养支架材料的方法。

背景技术

乙烯基甲醚/马来酸酐共聚物P(MVE-alt-MAH),又称乙烯甲醚-马来酸酐共聚物(甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物，甲氧基乙烯/马来酸酐共聚物)，是水溶性电解质聚合物，是人工合成化合物中少数几种的对人体和动物无毒无害的物质。因产品具有良好的化学稳定性、低毒性、生物相容性、络合性、螯合性、粘合性、凝聚性、成膜性、兼有亲水和疏水的独特性能，该产品在现代工业中有广泛的用途，可以起到分散剂、偶联剂、稳定剂、增稠剂、乳化剂、增溶剂、缓蚀剂、成膜剂和抗静电剂的作用。可以作为交联剂，制备具有大孔结构的高分子材料。

组织工程支架材料是指替代细胞外基质使用的生物相容性医学材料。除要考虑材料的组织相容性外，还要考虑力学相容性—粘弹性，合适的三维立体结构。孔隙率应该达到90％以上，有较大的比表面积，有利于黏附细胞，容纳细胞因子、营养物质，同时具有均匀分布和互相连通的孔结构，有利于细胞在整个支架体内部形成网络分布，有利于代谢废物的排出和血管神经的长入，保证再生组织具有三维有机结构。

蛋清含有细胞生长发育所需要的全部营养和信号成分，是一种以水作为介质，以蛋白作为分散相的胶体物质，约占鸡蛋总重的60％～63％。其中的85％～89％为水分，而剩余的固形物中，约有80％的蛋白质，其力学性能及形貌有较大范围的可改性调节。通过对蛋清培养支架材料采用不同方式改性，用于研究不同的材料硬度和形貌微环境对细胞行为的影响。

P(MVE-alt-MAH)和蛋白质的酰胺化反应通过1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为活化剂和催化剂得以进行。以10mg/ml的EDC活化羧基15-20min，pH5.0，然后用10mg/ml NHS来激活反应15-20min。调节pH7.2左右加入蛋白，37℃反应12h。偶联时EDC反应的最佳条件是pH 4.5(或者在4-6范围之间)，使用精密pH试纸测定。反应时间6h以上，延长到12h会更好。反应完应把小分子量的脲除掉。

酰胺键偶合在弱碱条件下进行：1.称NHS与反应容器中。(NHS稳定性比EDC好)2.称EDC。(这步要快，EDC在空气中会受潮水解，尽量使用5倍Sulfo-NHS摩尔以上的量)3.加入PBS buffer。4.用NaHCO₃10％或者NaOH(1M)将pH调至中性反应。EDC/NHS是把两种物质的-NH₂和-COOH交联起来。COOH与EDC反应，反应后的物质再与NH₂反应，中间NHS是加速反应EDC很容易失活，半衰期只有120min，要注意马上使用，并且防潮。

EDC起到了一个活化羧基的作用，EDC能够和羧基反应形成一个中间物，然后这个中间物再与氨基作用，使得氨基和羧基反应形成相应的共价键。NHS的作用就是稳定这个中间物，减少副反应的发生。

蛋白质化学交联是一类重要化学修饰反应，所用交联剂为含有双功能基团的化学试剂。化学交联型具有良好的力学性能和稳定性。因为P(MVE-alt-MAH)天然安全无毒副作用，所以是目前研究的热点，可用于生物医学组织工程高分子的交联改性制备大孔支架材料。

发明内容

本发明的目的在于为了提供一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，工艺简单，周期短，且适用于批量生产。

本发明的另一个目的在于提供一种新型改性蛋清细胞培养支架材料，交联度均匀，表面多皱褶或多大孔，形貌结构统一。

本发明提供的技术方案如下：一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制质量百分比浓度为20％的P(MVE-alt-MAH)水溶液，取0.025～0.2g的P(MVE-alt-MAH)水溶液加入反应器皿中；

(2)取质量百分比浓度为10％的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE-alt-MAH)水溶液中，调节pH为5-6，反应10-15min；加入1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺活化15-20min；再加N-羟基琥珀酰亚胺反应15-20min；1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1；

(3)调节pH7.2，再加入2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，25～37℃下充分交联反应完全；