[发明专利]一种高效分泌表达转肽酶SortaseA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，属于基因工程领域。

背景技术

Sortase A发现于革兰氏阳性菌中，是一种介导细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的转肽酶。Sortase A不仅催化反应效率高，而且其作用的靶蛋白必须具有特异性识别序列LPXTG(X为任意氨基酸)。自Sortase A被发现以来，其应用范围不断扩大，涉及疫苗研发、核酸修饰、蛋白修饰、蛋白多肽连接和固定化等领域。

2001年，Schneewind课题组首次应用pET9a载体在E.coli BL21(DE3)中成功表达了Sortase A。其蛋白表达量可以满足实验室水平研究Sortase A的需求，但不利于Sortase A的纯化及后续的酶活性检测或酶学性质研究。此外，Sortase A的胞内生产由于需要经过破壁等步骤工业化生产的成本较高。因此，利用大肠杆菌的胞外分泌表达方式更适合Sortase A的工业化生产，更有利于其在各个领域的拓展和应用。

利用重组大肠杆菌胞外分泌Sortase A所面临的主要困难是带信号肽的目的蛋白只能转运到周至空间，但由于缺乏相应的外转运机制，只有少部分Sortase A可以渗透到培养基当中。目前解决该问题的一个主要策略是利用化学添加剂破坏细胞壁的完整性。但不同的化学试剂作用的效果不一致，相同化学试剂对不同目的蛋白或者不同宿主的影响也不一致，相同化学试剂的添加浓度以及添加时间也会对目的蛋白的胞外分泌产生显著的影响。如甘氨酸为，1％的甘氨酸对环糊精葡基转移酶的胞外分泌有明显的促进作用，而甘氨酸的添加对目的蛋白如磷脂酶C以及抗地高辛人单链抗体的分泌则具有抑制作用。

发明内容

本发明首先提供了一种重组表达Sortase A酶的重组大肠杆菌，是将来源于金黄色葡萄球菌的去除N端信号肽的srt基因，以pET22b为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为宿主构建得到的重组菌。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述重组大肠杆菌高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，在添加IPTG诱导表达Sortase A的同时添加0.75％(g/100mL)的甘氨酸，并在诱导表达6小时后再添加2％(g/100mL)的甘氨酸。

在本发明的一种实施方式中，按2％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基装液量为10％的摇瓶，37℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.6之后，添加终浓度为1mM的IPTG和0.75％(g/100mL)的甘氨酸进行诱导表达，30℃，250rpm，并在诱导6h后添加2％(g/100 mL)的甘氨酸，总诱导培养时间为48h。

在本发明的一种实施方式中，按10％的接种量将预先培养好的种子接入发酵罐，7L发酵罐中所含发酵培养基为3L，通气量为3vvm，转速为500rpm，37℃培养，在OD₆₀₀达到0.6后加入终浓度为1mM的IPTG和0.75％(m/v)的甘氨酸，降温至30℃诱导，并在诱导6h后添加2％(m/v)的甘氨酸，总诱导培养时间为48h。

在本发明的一种实施方式中，种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，去离子水定容至1L。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨12g，甘油4g，去离子水定容至900mL，KH₂PO₄2.31g，K₂HPO_4.3H₂O 16.4g，去离子水定容至100mL，磷酸盐和其余成分分开灭菌，再合并成1L；种子培养基和发酵培养基以121℃灭菌20min。

在本发明的一种实施方式中，种子培养液获得方法为：将重组菌接种到种子培养基中，10mL试管装液3mL，温度为37℃，转速250rpm，培养时间为12-18h。