[发明专利]一种胎儿游离DNA文库定量的标准品及其制备方法

权利要求书

1.一种胎儿游离DNA文库定量的标准品的制备方法，其步骤如下：

(1)接头序列与引物合成：合成接头序列双链Adapter S1和Adapter S2，并在接头序列上设计qPCR扩增的引物对NIPT-Library F与NIPT-Library R，如下：

Adapter S1：

5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3′(+)

3′-CCCGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC-5′(-)

Adapter S2：

5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3′(+)

3′-CCCGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5′(-)

NIPT-Library F：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3’

NIPT-Library R：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’

(2)模拟胎儿游离DNA的文库制备：提取人类基因组DNA，将其物理超声打断为160bp～200bp的DNA片段；利用T4 DNA连接酶将Adapter S1和Adapter S2序列与160bp～200bp的DNA片段进行连接后，E-Gel胶回收260bp片段；

(3)文库扩增与纯化：利用NIPT-Library F、NIPT-Library R引物与高保真DNA聚合酶扩增步骤(2)中回收的DNA片段，继而利用磁珠纯化扩增DNA并溶解于无核酸酶水中；

(4)制作文库标准曲线：利用Qubit 2.0定量构建好的文库标准品在测序仪上检测，得到Reads数大于80M后再进行10倍梯度的稀释，经qPCR检测后得到Ct值并建立文库标准曲线；

(5)样本检测：待检样本的文库DNA通过文库标准曲线进行浓度确定后用测序仪检测，增加样本之间数据量的均匀性。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征还在于所述步骤(1)中的Adapter S1和Adapter S2序列，其负链3’端连续三个C碱基为通过硫代磷酸化修饰的粘性末端，5’端经过去磷酸化修饰。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征还在于所述步骤(2)中物理超声的条件为：频率0.5min超声/0.5min冷却停止，15min/循环，3个循环。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征还在于所述步骤(3)文库扩增的反应条件为：98℃ 2min，98℃ 15s，62℃ 15s，70℃ 1min，共10个循环，70℃延长5min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，建立的标准品主要用于胎儿染色体非整倍体T21、T18和T13的无创产前筛查和诊断。