[发明专利]一种胎儿游离DNA文库定量的标准品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，属于胎儿染色体非整倍体的无创产前检测范畴，涉及半导体测序法检测胎儿染色非整倍体21三体、18三体、13三体的文库DNA浓度的qPCR定量标准品及其制备方法。

背景技术

染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切关系。该类疾病的发病率随着孕妇年龄的增高而增高。据文献报道我国每年出生染色体异常的新生儿约10万人，在活婴儿中染色体异常者占0.3％，而其中21三体、18三体、13三体综合征是临床最常见和最易出现的染色体异常疾病。目前21三体、18三体、13三体综合征的治疗缺乏有效方法，因此普及染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对降低出生缺陷的发生有着非常重要的意义，这有利于提高人口质量，实现优生优育。

利用高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法相比传统方法具有明显优势。该方法只需抽取母体外周血进行检测，可以避免传统的侵入性方法可能给孕妇和胎儿带来的危害；另外直接检测母亲和胎儿的DNA序列，相比于检测血清蛋白标志物和超声波检测，准确性和灵敏度以及可靠性都大大提高。因此，通过深度测序，能够对孕妇血浆微量胎儿游离DNA进行准确检测，可以克服传统检测方法因胎儿游离DNA含量过低而导致检测结果假阴性过高的缺点。胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)基于高通量测序原理，对这些胎儿游离DNA进行检测，利用生物信息学分析系统对检测结果进行分析，获得胎儿染色体数目的详细信息，实现对21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征进行快速的产前辅助诊断。通过半导体测序实验得到的DNA数据量(Unique Reads数)需达到3.5M Reads(原始Reads需5M左右)才能对胎儿染色体非整倍体的症状进行明确判断。

目前半导体测序系统上对样品进行检测，每次实验可产出80M左右的Reads，理论每次实验可检测16个样品。但由于测序芯片中含有165M个微孔，需要的文库DNA分子量仅为10⁸个DNA拷贝数，即10^-15mol，如此低的浓度必定会造成16个样本很难等量均匀地混合，这将导致某些样本测序得到的数据量达不到要求而需要重新检测，这既浪费了成本，也拖延了检测时间。目前胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)每次建议检测12个样品，因此在保证每个样本DNA都能达到足够Reads数的前提下，增加单次实验的样品数量成为了必要。

现有胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)文库浓度是用Qubit荧光法检测的，只有当DNA与荧光的Molecular染料结合后，才能发出荧光信号，因此该方法只检测靶分子(而不是污染物)的浓度，相对于传统的分光光度更准确，更精密。但Qubit检测方法在高通量基因测序过程同样有一定的缺陷，即检测范围为0.1ng/μL-10ng/μL，对于加入的10⁸个DNA分子难以精确定量。因此最低可以检测到100个DNA分子拷贝的qPCR技术应用在高通量测序上无疑是非常必要的。利用DNA标准品建立标准曲线，得到文库DNA的拷贝数，再进行等量混合后上机测序。

目前，市场上该检测方法涉及的文库DNA浓度的qPCR定量标准品几乎没有，这严重影响染色体疾病的产前筛查和诊断过程的效率，增加了成本。为增加检验试剂盒在检测过程中的有效性，本发明以高通量测序技术用于孕妇血浆游离胎儿DNA的染色体非整倍体(T21、T18和T13)国家标准品为溯源，然后将人类基因组DNA打断成长度为160～200bp的DNA片段，利用该试剂盒进行文库制备，经Qubit 2.0检测后稀释至一定浓度作为胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)文库DNA浓度检测的qPCR定量标准品。

发明内容

本发明的目的是提供一种胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)文库DNA浓度的qPCR定量标准品及其制备方法。

为了实现本发明目的，发明了一种胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)文库DNA浓度的qPCR定量标准品。

本发明的qPCR定量标准品为含有一段长度为260bp左右DNA片段的无核酸酶溶液。

本发明的qPCR定量标准品的DNA片段两端含有测序的接头序列，与文库DNA特征相同。