[发明专利]针对wbgZ基因鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测宋内氏志贺氏菌的方法，尤其涉及一种针对wbgZ基因鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法，本发明还涉及宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测引物和试剂盒，属于宋内氏志贺氏菌的检测领域。

背景技术

志贺氏菌仍然在世界许多国家和地区引发主要的健康问题，特别在不发达国家和发展中国家由于缺乏清洁的水源、缺少必要的卫生医疗设备等诸多因素，导致志贺氏菌引发的公共健康问题更加严重。世界范围内，志贺氏菌病在1～5岁或更大一点幼儿中发病率和致死率最高。大多数志贺氏菌病与三种志贺氏菌息息相关，即福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌。在这三种志贺氏菌中，宋内氏志贺氏菌主要在工业化国家被发现，福氏志贺氏菌主要在发展中国家被发现，痢疾志贺氏菌是唯一引发流行和大流行志贺氏菌病的菌株。

目前，在发展中国家由于缺乏准确可靠的鉴定技术，大多数志贺氏菌都无法鉴定分群，对志贺氏菌的鉴定分群主要依靠常规生化鉴定方法、免疫学方法，这些方法比较复杂、耗时耗力、敏感性低。也有一些学者研究建立了分子生物学检测技术主要对志贺氏菌属进行鉴定，但也存在一定的局限性而导致错检和漏检现象。因此，建立一种准确可靠的、快捷的志贺氏菌鉴定分群技术显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测的引物对及探针；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法；

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明根据宋内氏志贺氏菌的wbgZ基因设计引物和探针。本发明首先公开了针对wbgZ基因鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR的引物对及探针，其中，所述引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；或者，

所述引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；或者，

所述引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.8所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示。

本发明还根据ompA基因设计3对引物和探针作为内参照，所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.10所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.11所示的下游引物组成，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；或者，所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.14所示的下游引物组成，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示；或者，所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.16所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.17所示的下游引物组成，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.18所示。

本发明用17株志贺氏菌和19株非志贺氏菌对宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法所用的引物和探针进行了特异性实验，结果表明，引物对和探针Son1-F/Son1-R/Son1-P(即由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示)特异性好，仅在宋内氏志贺氏菌出现扩增曲线，在一些其它志贺氏菌(如福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌)和非志贺氏菌均未出现扩增曲线。内参照引物和探针Ctr1-F/Ctr1-R/Ctr1-P(即由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示)在所有细菌中均能够出现扩增曲线。