[发明专利]针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法和试剂盒

权利要求书

1.针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测引物对及探针，其特征在于：所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示；或者，

所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.6所示；或者，

所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.8所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.9所示。

2.权利要求1所述引物对及探针在鉴定福氏志贺氏菌中的应用。

3.一种针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括：(1)提取待测样品DNA；(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对和探针建立PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；(3)如果实时荧光PCR扩增结果中出现S型扩增曲线，则判定待检测样品中含有福氏志贺氏菌；如果实时荧光PCR扩增结果中没有出现S型扩增曲线，则判定待检测样品中不含福氏志贺氏菌。

4.按照权利要求3所述的实时荧光PCR方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为25μL：20μg/mL模板DNA2.0μL，FastStartUniversalProbeMaster12.5μL，10pmol/L上游引物1.0μL、10pmol/L下游引物1.0μL、10pmol/L探针1.0μL，灭菌蒸馏水7.5μL。

5.按照权利要求4所述的实时荧光PCR方法，其特征在于：所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示，所述探针的核苷酸序列SEQIDNo.3所示。

6.按照权利要求3、4或5所述的实时荧光PCR方法，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

优选的，所述荧光报告基团为FAM荧光报告基团，所述荧光淬灭基团为TAMRA荧光淬灭基团。

7.按照权利要求3所述的实时荧光PCR方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min，1个循环；阶段二：95℃变性30s，55℃退火30s，40个循环。

8.一种针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测试剂盒，包括：FastStartUniversalProbeMaster，扩增引物对、探针和灭菌蒸馏水；其特征在于：所述扩增引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示。

9.按照权利要求8所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：内参照引物对和探针；

优选的，所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.10所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.11所示的下游引物组成，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.12所示；或者，

所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.14所示的下游引物组成，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.15所示；或者，

所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.16所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.17所示的下游引物组成，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.18所示；

其中，所述内参照引物对和探针的退火温度为57℃。

10.按照权利要求8或9所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

优选的，所述荧光报告基团为FAM荧光报告基团，所述荧光淬灭基团为TAMRA荧光淬灭基团。