[发明专利]针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及志贺氏菌分子检测，尤其涉及针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测引物和探针、检测方法及试剂盒，属于福氏志贺氏菌的检测领域。

背景技术

志贺氏菌在世界许多国家和地区引发主要的健康问题，特别在不发达国家和发展中国家由于缺乏清洁的水源、缺少必要的卫生医疗设备等诸多因素，导致志贺氏菌引发的公共健康问题更加严重。志贺氏菌主要通过消化道途径传播，侵袭肠上皮细胞，引起以发热、腹痛、腹泻为特征的典型的痢疾症状，严重危害人类健康，特别是营养不良的儿童和免疫缺陷病患者最易感，传染源主要为病人和带菌者，通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染，人类对志贺氏菌易感。世界范围内，志贺氏菌病在1～5岁或更大一点幼儿中发病率和致死率最高。在成年患者中，10～100CFU志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发严重的炎症反应。大多数志贺氏菌病与三种志贺氏菌息息相关，即福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌。其中，福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri,S.flexneri)主要在发展中国家被发现，是引起急性感染性腹泻最主要的病原体之一，少至10个细菌即可引起感染。该菌毒素毒性强烈，可引起脓血粘液便、发热、神志障碍、中毒性休克等一系列毒血症症状，甚至危及生命。

近年来，由于多重耐药志贺氏菌株的出现，使得世界范围内许多国家和地区志贺氏菌病例数量增加，早期确诊志贺氏菌病需要准确快速的检测技术。目前，在发展中国家由于缺乏准确可靠的鉴定技术，大多数志贺氏菌都无法鉴定分群，对志贺氏菌的鉴定分群主要依靠常规生化鉴定方法、免疫学方法，这些方法比较复杂、耗时耗力、敏感性低。分子生物学检测方法是近几年来发展起来的快速检测方法，是目前检验检疫系统推广使用的检验检疫手段之一。目前，国内外有许多作者建立了食品中志贺氏菌属的PCR检测方法，如国外S.Dutta等(S.Dutta,A.Chatterjee,P.Duttaetal.,“SensitivityandperformancecharacteristicsofadirectPCRwithstoolsamplesincomparisontoconventionaltechniquesfordiagnosisofShigellaandenteroinvasiveEscherichiacoliinfectioninchildrenwithacutediarrhoeainCalcutta,India,”JournalofMedicalMicrobiology,vol.50,no.8,pp.667–674,2001.)和HoungHSH(H.S.H.Houng,O.Sethabutr,andP.Echeverria,“AsimplepolymerasechainreactiontechniquetodetectanddifferentiateShigellaandenteroinvasiveEscherichiacoliinhumanfeces,”DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease,vol.28,no.1,pp.19–25,1997.)建立的志贺氏菌属的PCR检测方法，但这些方法存在一定的局限性而导致错检和漏检现象。在中国，许龙岩等(许龙岩,李志勇,王志强,等.PCR方法检测志贺氏菌的研究.检验检疫科学,2003,13(5):28-29.)、蔡亦红(蔡亦红.PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立.中国人兽共患病学报,2008,24(2):150-153.)、邱杨等(邱杨,唐丽霞,赵丽,等.志贺氏菌实时荧光PCR检测试剂的研制.现代食品科技,2008,24(11):1151-1154.)等建立的食品中PCR检测方法的均只鉴定到志贺氏菌属。因此，建立一种准确可靠的、快捷的福氏志贺氏菌鉴定方法显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一组针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测引物对及探针；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法；

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种针对rfc基因鉴定福氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：