[发明专利]一种基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法

说明书

本发明公开了一种本基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法，属于磷脂定量检测方法技术领域。该方法主要利用三甲基硅重氮甲烷在甲基叔丁基醚/甲醇/1N盐酸和甲基叔丁基醚/氘代甲醇/1N氘代盐酸溶液体系中，可以分别原位生成重氮甲烷和氘标记的重氮甲烷，进而分别将磷脂分子中的磷酸基团或羧酸基团甲酯化，产生物理和化学性质相同但具有分子量差异的轻、重同位素标记的磷脂甲酯化衍生物。通过比较轻、重同位素标记的质谱峰信号的相对强弱，关联于样本中磷脂分子的量，就可以达到对磷脂进行相对定量的目的。本发明提供的基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法具有增强的灵敏度，并在较短的时间内完成。

技术领域

本发明涉及磷脂定量检测方法技术领域，特别是涉及一种基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法。

背景技术

磷脂不仅是细胞膜的重要组成成分，也广泛参与调节多种生命活动过程，包括能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，以及细胞凋亡等。磷脂的异常代谢与动脉硬化症、糖尿病、肥胖症、Alzheimer病以及肿瘤发生也密切相关。因此，从“组学”的角度出发，系统性、规模性地研究磷脂分子在不同生理或病理状态下组成及相对量的动态变化分析，对揭示磷脂代谢与细胞、器官乃至机体的生理、病理过程之间的关系及其分子机理，进而发掘与疾病发生相关的重要生物标记物，促进疾病的早期诊断和治疗具有重要的意义。

近年来，基于生物质谱的定量分析技术因其高灵敏度、高分辨率、高准确性和高通量性等特点，已经成为磷脂定量分析的主要工具。然而，目前不同样本磷脂分子的质谱鉴定和定量通常是分开分析，然后通过内标进行参比或定量，具有一定的局限性。例如，目前商品化的磷脂内标不仅价格昂贵，种类有限，而且由于磷脂分子含有不饱和双键，容易氧化，其保存有一定的限制。磷脂分子的电离化效率也容易受到不同时间离子喷雾稳定性、脂肪酸链长度和不饱和度对离子效率的影响等不同因素的影响，从而可能导致质谱定量的时候引入一定的误差。另一方面，利用电喷雾离子化-质谱(ESI-MS)进行磷脂类脂质分子分析和定量时，不同种类的磷脂分子因自身结构(主要是极性头部)及溶液组成的差异具有不同的离子化倾向，从而导致在利用ESI-MS对生物样本中的磷脂组进行定性和定量分析时要结合正离子和负离子模式，从而导致分析时间的增长。同时，在负离子模式下，部分磷脂的检测灵敏度相对较低。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法，其通过比较轻、重同位素标记的质谱峰信号的相对强弱，关联于样本中磷脂分子的量，其可以达到对磷脂进行相对定量的目的。其具有增强的灵敏度，并在较短的时间内完成。

为了达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

本发明提供的基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法包括以下步骤：

步骤1：从待检测样本中提取待检测磷脂；

步骤2：在甲基叔丁基醚/甲醇/1N盐酸溶液体系中，使三甲基硅重氮甲烷原位生成重氮甲烷；在甲基叔丁基醚/氘代甲醇/1N氘代盐酸溶液体系中，使三甲基硅重氮甲烷原位生成氘标记的重氮甲烷；

步骤3：所述重氮甲烷将所述待检测磷脂分子中的磷酸基团或羧酸基团甲酯化，产生轻同位素标记的磷酸甲酯化衍生物；所述氘标记的重氮甲烷将待检测磷脂分子中的磷酸基团或羧酸基团甲酯化，产生重同位素标记的磷酸甲酯化衍生物；

步骤4：将所述轻同位素标记的磷脂甲酯化衍生物和重同位素标记的磷脂甲酯化衍生物混合后，电离样本中分别经过轻同位素甲酯化衍生、重同位素甲酯化衍生的磷脂分子，产生一对具有质量差异的分子离子峰，所述待检测的离子种类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇；