[发明专利]IL-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞因子检测技术领域，具体涉及一种IL-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法。

背景技术

细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。其中，比较重要的有IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-β和神经白细胞素等，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。

已经有诸多的文献和研究成果表明，IL-4表达水平与多种疾病和机体免疫密切相关。通过对IL-4表达水平的检测，可以利于很多必要信息的更早获取以及相关某些疾病的早期诊断。而现有IL-4的检测中常使用免疫学测定法，比如使用率最高的ELISA试剂盒；但是现有的这些检测的试剂盒或者方法，其检测针对的是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，不是细胞因子产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制提供必要的信息，也不能反映细胞或组织内实时的细胞因子基因表达水平，所以检测的结果不能作为IL-4指标实时定点检测真实情况。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种能更真实和准确检测细胞或组织内实时的IL-4表达水平的IL-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。

基于上述检测引物，本发明还提出包括上述引物的IL-4检测试剂盒。

本发明的上述引物基于基因表达过程中编码IL-4的mRNA合成远先于分泌的IL-4蛋白产物，且蛋白质的表达量的多少与对应编码的mRNA的量成线性正比的关系；通过RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA，再通过mRNA的量即可得到对应IL-4蛋白产物的量；其检测的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，而是IL-4产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制的实时定点水平；其能更真实和准确反应细胞或组织内实时的IL-4表达水平。

本发明基于上述引物和试剂盒，进一步提出一种采用上述引物构建竞争性RT-PCR进行IL-4半定量检测方法，包括如下步骤：

获取IL-4对照组细胞和IL-4待测组细胞；

提取所述IL-4对照组细胞的总RNA，并用具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的竞争性引物P3进行RT-PCR，得到竞争模板；

提取所述IL-4待测组细胞的总RNA，并进行反转录获得待测cDNA模板；

将所述待测cDNA模板和竞争模板混合后，用具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2进行PCR，得到靶序列扩增产物。

上述方法的过程，通过引物平P1和引物P2扩增的IL-4cDNA靶片段长474bp，而用引物P1和引物P3扩增的管家基因长454bp，比靶片段短22bp；竞争模板与靶片段序列差异小，在作竞争PCR时可将影响因素降至低水平，从而使检测结果更能反映样本的真实情况；且所用的竞争模板与靶序列电泳位置接近，为判断RT-PCR产物电泳条带提供了较理想的参照物，可避免对非特异性条带的误判通过测定电泳带的密度，即可对靶序列的扩增产物进行定量，从而推知所测样本中相应mRNA的含量，更加接近真实的表达水平。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。