[发明专利]一种pH值稳定的淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种pH值稳定的淋巴细胞无血清培养基，由基础培养基、转铁蛋白10mg/L转铁蛋白、0.01mg/L亚硒酸钠、110mg/L丙酮酸、1.5mg/L乙醇胺、10mg/L胰岛素、10mg/L‑30mg/L谷氨酰胺替代物、300mg/L脂质型牛血清蛋白、0.001mg/L硫酸铜、0.0005mg/L偏钒酸铵、0.00005mg/L二氯化锰、0.8mg/L硫酸锌、2mg/L维生素E、100mg/L植物血球凝集素(PHA)和10‑50mMpH缓冲系统组成。本发明还提供该培养基的制备方法和应用。本发明的培养基能提高淋巴细胞分化，得到大量处于分裂相的淋巴细胞，且pH值稳定，利于培养基的稳定保存。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种pH值稳定的淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用。

背景技术

遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。有先天性的，如先天愚型、多指(趾)、先天性聋哑、血友病等，也有后天通过基因突变和染色体病变引起的。遗传病分为三大类，其一是染色体病或染色体综合征，其二是单基因病，第三是多基因病，目前已发现的遗传病超过3000种，估计每100个新生儿中约有3～10个患有各种程度不同的遗传病。遗传病涉及的学科很多，包括妇产科学－不孕不育、优生优育、内分泌紊乱；血液病学－慢性粒细胞性白血病，急性粒细胞性白血病，骨髓增生异常综合征，急性淋巴细胞性白血病等；儿科学－出生缺陷；肿瘤学；内科学－放射病、染色体断裂综合征等，具有先天性、终生性和家族性、病种多、发病率高等特点。临床常见的高血压、糖尿病、哮喘、癌症、忧郁症、老年痴呆等与遗传有关。

目前，对于遗传病的诊断主要采用的还是细胞遗传学的方法，即染色体核型分析。染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色体分带技术对某一生物的染色体进行分析，比较，排序，编号，是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、型态与功能之间的关系所不可缺少的重要手段。染色体核型分析也是临床上广泛开展的对遗传病进行诊断的一种基本方法，经核型分析后，可以根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因，比如是由于缺少了什么样的基因才导致的这种疾病。因此染色体核型分析在遗传病的诊断和筛查上具有重要意义。

染色体核型分析的原理和基本过程：利用PHA(植物血凝素)刺激成熟的淋巴细胞再次分裂；利用秋水仙素在细胞分裂中期破坏纺锤丝，抑制细胞分裂，形成染色体的形态；通过胰酶消化或缓冲液作用，将染色体显带，通过带纹和数目的分析判断染色体数目和结构的情况。从以上原理可以看出，染色体核型分析技术的关键是培养出合格的淋巴细胞。

传统的淋巴细胞培养基组成：基础培养基(RP1640培养基)、抗菌素、小牛血清(或者胎牛血清)、淋巴细胞刺激因子等组成。但是这种培养基含有小牛血清，成分复杂，有效期短，容易出现病毒、真菌、支原体等污染，还有就是血清质量标准难以统一，这对大批量配制、生产来说，很容易造成配制的质量培养基不稳定；并且胎牛血清以及小牛血清市价越来越贵。

为了降低成本，明确培养基成分，减少病毒、支原体等的污染，已有改良的培养基的研究报道，基本上就是在基础培养基的基础上添加生长因子、脂肪酸、转铁蛋白等。例如：中国专利申请CN03147874.3公开了用于培养淋巴细胞的无血清培养基，包含了下列组分：基本培养基、白介素-2、脂肪酸、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白，其中基础培养基是McCoy’s5A改良的Eagle培养基与Ham’s-F12培养基以1∶1的比例混合而形成的培养基，Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham’s-F12培养基以1∶1的比例混合而形成的培养基，或Iscove改良的Dulbecco培养基，该专利通过加入脂肪酸、IL-2、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白来代替血清；中国专利申请201310082166公开了一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人血清白蛋白、2-巯基乙醇、N-乙酰-半胱氨酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、柠檬酸铁、氢化可的松、乙醇胺、非必需氨基酸，该专利通过一些激素、氨基酸、脂质、人转铁蛋白、人血清白蛋白等代替血清。