[发明专利]基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，属于生物技术领域。

技术背景

在动物的身体里，有无数微小的生物时时刻刻与动物同呼吸、共命运。它们就是存在于动物肠道内的大量微生物群。已有研究发现，肠道微生物与免疫系统有着密切的关系。2012年4月，日本科学家在《科学》报告，发现一种免疫抑制性受体控制着肠道菌群的构成，如果这种受体缺失，肠道内的微生态环境就会紊乱，会导致全身免疫系统过度活跃，进而有可能出现自体免疫疾病等病态变化。研究者认为，这些新发现有望帮助开发预防或缓解自体免疫疾病症状的新方法。同时2011年有研究发现，每个人在其消化道中都有一个领导菌群的主导菌种，人类可以根据其微生物特征而划分为3种不同的“肠类型”。这一发现可帮助厘清健康和疾病状态时饮食、微生物、身体之间的相互作用。该成果入选了当年《科学》杂志评选的十大科学进展。

科学家们还发现，不同国家人群中的肠道微生物存在很多差异，差异最显著的是微生物的多样性程度。例如：印第安人和马拉维人的肠道微生物组比美国人的肠道微生物具有更大的多样性。有观点认为，微生物多样性程度越高，人体越健康。该研究还发现，尽管来自三种不同地域人群的肠道微生物组存在很多差异，但它们之间也存在惊人的相似性。如，三个不同国家的婴儿微生物组形成过程具有共同的模式，即婴儿需要6-9个月的时间来获得第一组6-700个细菌，然后再经过几年的时间才能获得成人的微生物组。该研究还发现了一个非常有趣的现象，即肠道微生物组的构成会随年龄增长而发生改变，而这一变化恰恰适应了不同年龄段人体的需求。

动物肠道微生物内的微生物的多样性对研究肠道微生物与动物健康有着重大关系。研究肠道微生物的多样性就要求我们能从动物的粪便中提取到微生物的基因组，从而对其多样性进行研究，本发明提供一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，利用该试剂盒能够方便、快捷地提取动物粪便微生物基因组。

发明内容：

本发明提供一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，该试剂盒在破碎细胞后先用CTAB溶液去除蛋白杂质，同时利用硅胶模吸附柱吸附柱吸附基因组DNA，最后在采用特有的去蛋白液和漂洗液洗去剩余的蛋白等杂质，利用该试剂盒可以快速提取到动物粪便微生物基因组。

一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，包括粪便的前处理、粪便中微生物细胞的裂解、DNA的游离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，具体步骤如下：

粪便的前处理：称取0.3-0.5g新鲜粪便于2ml离心管中，加入1-2ml Buffer A振荡1-2min，3000-5000rpm/min离心10-20min，转移上清至新的离心管中，10000-12000rpm/min离心10-20min。弃上清，保留沉淀。

粪便中微生物细胞的裂解：往沉淀中加入450-600μl Buffer B和50-60μl Buffer C，混匀后37-40℃水浴1-2h，加入65-70μl Buffer D和65-70μl Buffer E，混匀后37-60℃水浴1-2h。加入100-200μl Buffer F和50-100μl Buffer G溶液，65-80℃水浴10-20min。

DNA的游离与杂蛋白的抽除：往溶液中加入600-800μl Buffer H，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min离心10-20min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的Buffer I，12000-13000rpm/min离心10-20min，将上清移至新的离心管中。

DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，加入500-600μl去蛋白液，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，加入300-500μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，加入500-600μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，12000-13000rpm/min离心1-2min，静置吹干。

DNA洗脱：往吸附柱中加入30-60μl洗脱液，12000-13000rpm/min离心1-2min，所得液体为粪便微生物基因组。取3-6μl DNA水溶液，于1-2％琼脂糖凝胶中电泳检测。

试剂的配方如下：