[发明专利]一种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列及应用

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列及应用。

背景技术

水稻(OryzasativaL.)是世界上重要的粮食作物之一，养活着全球半数以上的人口，也是我国近一半人口的主要食物来源。随着人口的不断增长，人们对粮食的需求也越来越大。杂种优势的有效利用对水稻产量的提高起了重要的推动作用，然而，单位面积的水稻产量一直没有太大提升，而且随着耕地面积的减少，水稻的种植面积一直在下降，迫切需要借助新的遗传改良策略来大力提高水稻的产量。近几年，随着几个控制谷粒大小的基因(GS3、SW5和GW8)、粒宽粒重(GW2、GW5)、粒长粒宽的基因(qGLl、qGWl、GS7和qSS7)及千粒重基因(TGW6)等与产量相关基因相继被克隆，部分产量相关基因已经被广泛用于水稻高产品种的培育中。这些产量性状相关基因中，以调控粒长粒重的千粒重基因(Thousand-grainWeight6，TGW6)的遗传力最大，Ishimaru等(2013)的研究发现，Kasalath的tgw6基因能使日本晴在抽穗前的籽粒碳水化合物的积累增加，从而使日本晴产量增加15％却不影响稻米品质；进一步研究发现，Kasalath的tgw6基因在313bp处发生单碱基缺失造成移码突变而使得翻译提前终止不能形成成熟蛋白，从而通过对源器官的多效影响增加千粒重从而使水稻增产。TGW6基因编码吲哚乙酸-葡糖糖水解酶，其功能缺失突变会引起胚乳中吲哚乙酸含量下降，进而使细胞数量增加，粒长变长、粒重增加。

一直以来，科学家都未发现准确、便捷、高效率的植物基因组编辑的方法。最近发现的CRISPR/Cas9系统因其简易和有效性已被广泛应用于包括植物在内的多种生物的基因组编辑中，该系统仅需要短引导RNA和核酸酶就可以对特定生物的靶基因进行定点突变，为生物定点诱变技术发展注入了新的活力。目前CRISPR/Cas9系统已成功在拟南芥、烟草、甜橙、水稻、小麦、高粱、玉米以及苔藓植物地钱等植物中实现了定点基因组编辑，但对水稻育种中有重要价值的产量、品质、育性等关键基因的定向编辑的研究鲜有报道，更缺乏对相关突变体的育种价值评价。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列，该引导RNA靶点序列可以用于创建水稻千粒重基因tgw6突变体。

本发明的另一目的在于提供上述水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列的应用。

一种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列，其寡核苷酸序列为：

TGW6U3-T1-F：5’-GGCAGCCAGCATCTGGACCTCGG3’；

TGW6U3-T1-R：5’-AAACCCGAGGTCCAGATGCTGGC3’；

TGW6U6a-T2-F：5’-GCCGGCTACAGCCATGAGAAGCA3’；

TGW6U6a-T2-R：5’-AAACTGCTTCTCATGGCTGTAGC3’；

TGW6U6b-T3-F：5’-GTTGAGGCAAGCGGCGACCGCGG3’；

TGW6U6b-T3-R：5’-AAACCCGCGGTCGCCGCTTGCCT3’；

所述的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列在编辑水稻基因组中的应用；

所述的应用包括将权利要求1所述的引导RNA靶点序列的寡核苷酸链退火形成双链与载体连接，形成gRNA表达盒；将gRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体；将三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体转化植物组织，并将转化的植物组织培育成转基因植株，得到水稻千粒重基因tgw6突变体；

一种三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体，含有上述靶点序列片段；

所述的三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体的制备方法，包含如下步骤：

将上述引导RNA靶点序列的寡核苷酸链退火形成双链，然后分别与BsaI酶切后的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA和pYL-U6b-gRNA连接，得到三个gRNA表达盒；然后通过Goldengatecloning的方法将gRNA表达盒全部依次装载到CRISPR/Cas9载体上，得到三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体；

所述的Goldengatecloning的引物优选为：