[发明专利]一种以改性硅藻土为载体的固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。本发明公开的固定化芽胞漆酶由芽胞杆菌属菌株所产的芽胞漆酶通过酰胺键固定在硅藻土表面或孔隙中得来；其制备过程包含芽胞的制备、硅藻土改性、固定和收集四个步骤，操作简便，酶活回收率高；其结合力强，载体资源丰富，价格低廉，是一种理想的固定化载体。本发明提供的固定化芽胞漆酶可直接用于染料的脱色处理，并且具有较高的可重复利用能力。

技术领域

本发明涉及一种固定化芽胞漆酶及其制备与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。

背景技术

漆酶(laccase)是一种含铜多酚氧化酶。漆酶可以氧化许多酚类物质，如单酚、二酚、多酚、氨基酚、甲氧基苯酚等，在介体的辅助下，还可以与非酚类物质反应。漆酶在催化底物氧化的同时，将氧还原为水，本身不会产生有害物质，是一种非常环保的生物催化剂，可用于染料脱色、饮料处理，制浆漂白以及生物传感器等研究和应用中。

漆酶广泛存在于真菌、细菌、植物和昆虫中。近年来的研究表明，细菌漆酶比真菌漆酶更耐碱耐热。因为纺织染料废水高温高碱性的特点，细菌漆酶被认为是纺织染料废水生物处理方法的潜在催化剂。固着于芽胞表面的CotA蛋白是研究得最深入的细菌，其异源表达于大肠杆菌的CotA漆酶和以芽胞整体作为催化剂的芽胞漆酶表现出了耐碱耐热的品质，在染料脱色中展现出了良好的应用潜力。

对酶进行固定化通常可以提高酶的稳定性、易于酶的分离，而且可以提高酶的重复使用率，降低工业化应用的成本。游离芽胞漆酶虽然比真菌漆酶更耐碱耐热，但不方便分离，难以重复利用，在工业化应用中受到限制。芽胞漆酶作为一种新兴的研究对象，至今鲜有固定化的报道。相对一般的酶，芽胞体积较大，呈刚性特征；相对于一般的丝状真菌，芽胞不可缠绕于其他纤维上，亦不会形成菌丝球；相对于一般单细胞，芽胞表面不是由一层细胞膜或细胞壁构成。所以，传统的固定化酶和固定化细胞的经验并不能完全适用于芽胞的固定化。例如，芽胞由于体积大而难以通过吸附法进行固定。

发明内容

本发明旨在提供一种简便可行的芽胞固定化方法，以此方法制备得到可重复利用的固定化芽胞漆酶，并应用于染料脱色。

所述固定化芽胞漆酶通过以下步骤来制备：

(1)制备芽胞杆菌属菌株所产的芽胞；

(2)改性硅藻土的制备：称取2g硅藻土，浸泡于20－100ml有机溶剂中，再往其中添加1－20ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷，充分混匀，再将其置于50－120℃水浴回流或摇床上旋转振荡2－24h；洗涤，抽滤并收集；

(3)共价连接：将制备好的改性硅藻土按20－100mg改性硅藻土:1ml缓冲液(pH5.0－8.0)分散到缓冲液；往上述混合物中添加碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.1－2.0mg/ml，并使用超声波振荡5－30min，使其充分分散；往含碳二亚胺盐酸盐的混合液中添加芽胞，使其终浓度为1.0－10.0mg/ml，并用超声波振荡处理10－60min；将经上述处理得到的混合物直接转移至摇床，在4－40℃，50－250r/min条件下处理1－48h；

(4)回收：芽胞与改性硅藻土混合物经混合固定化处理后，过滤，用缓冲液冲洗1－5次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于0－40℃。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的芽胞制备包括以下步骤：

①将产漆酶的芽胞杆菌属菌株在30℃条件下在生孢培养基上培养2d；

②以8000r/min的离心速度对上述培养物进行10min的离心，收集芽胞；

③水洗芽胞1次；

④水洗所得的的芽胞加入溶菌酶使其终浓度为1mg/ml，在37℃条件下保温2h。