[发明专利]一种快速鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种用于鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物组合物，其特征在于：包括1对特异性引物和1对特异性探针：

Bmvp-COIF1上游引物：5'  CTGGTCTAATCGGAGCCTGT  3'；

Bmvp-COIR1下游引物：5'  ATAAATGCGTGGGCAGTAAC  3' ；如SEQ ID NO.2、3所示；

所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：

5' AGAGTTAACCCAACCCGGCTCGCTTTTA 3'，如SEQ ID NO.4所示；

探针的5'端修饰有FAM荧光基团，3'端修饰有BHQ2猝灭基团。

2.一种用于鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物组合物，其特征在于：还包括内标特异性探针，该特异性探针的核苷酸序列如下：

5' -TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT- 3'；如SEQ ID NO.6所示；

该探针的5'端修饰有JOE荧光基团，3'端修饰有BHQ2猝灭基团。

3.一种用于鉴别金钱白花蛇的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的TaqMan探针引物组合物以及PCR扩增所必须的试剂。

4.根据权利要求3所述的用于鉴别金钱白花蛇的试剂盒，其特征在于：还包括外源性内标DNA片段，其核苷酸序列如下所示：

5'CTGGTCTAATCGGAGCCTGTATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCGTTACTGCCCACGCATTTAT3'；如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求3所述的用于鉴别金钱白花蛇的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增所必须的试剂包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶和超纯水。

6.一种鉴别金钱白花蛇的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，使用权利要求1～5中任一项所述的TaqMan探针引物组合物或试剂盒在鉴别金钱白花蛇制品真伪中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：鉴别方法为：取金钱白花蛇制品样品，提取基因组DNA，利用特异性引物及探针进行扩增，检测荧光信号，若在同时进行的空白、阳性对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35，说明DNA提取是有效的，金钱白花蛇特异探针信号（Bmvp）及内标质控(IMP)均被检出，Ct值<35，则判为阳性，若只有内标质控(IMP)均被检出，金钱白花蛇FAM特异探针没有检出，则判定为伪品。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增体系为：pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为1U，上下游引物的浓度各为0.4-1μM；特异性探针和内标特异性探针的浓度各为0.4-1μM，内标DNA的浓度为1pg/μl。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的条件为：95℃10min，95℃ 10s，63℃ 35s，收集荧光信号，45个循环。