[发明专利]一种快速鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及名贵中草药品种鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴别金钱白花蛇的方法，具体为一种快速鉴别金钱白花蛇真伪的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法。

背景技术

金钱白花蛇为《中国药典》2010年版一部收载的一种常用中药，来源于眼镜蛇科动物金钱白花蛇(Bungarus multicinctus Blyth)的幼蛇干燥体，呈圆盘状，盘径3-6cm，蛇体直径0.2-0.4cm，气微腥，味微咸。金钱白花蛇具有祛风、通络、止痉的功效，主要用于治疗风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼歪斜，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风疥癣，瘰疬恶疮等症。随着生态环境的恶化，动物类药材资源急剧减少，因为药源紧张，金钱白花蛇近年来价格涨幅很大。在利益驱使下，市场金钱白花蛇伪品越来越多，一般为赤链蛇、涂漆铅色水蛇等假冒，尤其在幼蛇阶段这些伪品形态鉴别相当困难，而且仅依据形态特征很难进行准确地鉴别。传统的识别金钱白花蛇真伪方法是通过观察表型，准确率很低，为了确保药物安全有效，找到一个简单快速准确地鉴定方法显得尤为重要。

近年来人们对金钱白花蛇的鉴别研究，已经从传统的性状鉴别发展到鳞片鉴别、显微鉴别、理化鉴别、生物学技术鉴别，尤其是PCR方法鉴别蛇类品种，准确度高，重现性好，与性状，显微、理化鉴别相比，具有无法比拟的优越性，也是鉴别金钱白花蛇真伪的最先进的技术手段之一。不少学者利用分子生物学技术手段对金钱白花蛇真伪鉴别：王义权、冯成强等基于银环蛇Cytb序列，设计鉴定金钱白花蛇的PCR反应及特异引物，发明专利CN101613759A和CN104120182A报道的PCR方法及特异引物虽然PCR产物长度不同，但均以普通PCR为基础结合琼脂糖凝胶电泳检测，操作较为繁琐，不能满足混伪品快速鉴定的要求。专利CN104164492A是依据序列差异并产生特定的限制性内切酶切位点，从而导致酶切片段长度的变化或片段数量的增减，进行鉴定。因该方法所需DNA样本量较大，对DNA的质量要求较高，还需要特定的限制性酶，操作更加繁琐，限制了其广泛应用。2003年Herbert等选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的一段序列在动物界不同分类水平上(门、目、种)进行分析，发现无论在那个分类水平上该基因都具有良好的识别力，从而提出建立一段长度为650bp的COI基因序列为基础的条形码识别方法。然而DNA条形码技术需要对物种序列进行基因测序，操作过程繁琐，周期较长。

以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已逐步成为食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来TaqMan探针实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的危险，已经广泛应用于各个领域。但目前未有任何公开或报道一种利用TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法快速鉴别金钱白花蛇源性的方法。因此，建立一种快速鉴别金钱白花蛇及其伪品的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法对名贵中药及中药制品安全的快速监管具有重要的创新性的实践意义。

发明内容：

为克服现有技术中的不足，本发明提供了一种鉴别金钱白花蛇的方法，具体为一种快速鉴别金钱白花蛇真伪的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的之一在于提供一种同时扩增金钱白花蛇动物源性成分的PCR扩增引物、TaqMan探针及PCR扩增条件。

本发明目的之二在于提供一种同时鉴别金钱白花蛇动物源性成分的实时荧光PCR定性检测方法。

为实现上述目的通过以下技术方案来实现：

一种用于鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物组合物，包括1对特异性引物和1对特异性探针：

Bmvp-COIF1上游引物：5'CTGGTCTAATCGGAGCCTGT 3'；

Bmvp-COIR1下游引物：5'ATAAATGCGTGGGCAGTAAC 3'；如SEQ ID NO.2、3所示；

所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：

5'AGAGTTAACCCAACCCGGCTCGCTTTTA3'，如SEQ ID NO.4所示；

探针的5'端修饰有FAM荧光基团，3'端修饰有BHQ2猝灭基团；

即为：Bmv-COIP:5'FAM-AGAGTTAACCCAACCCGGCTCGCTTTTA-BHQ23'。