[发明专利]一种治疗代谢疾病的突变细胞因子融合蛋白

说明书

本发明公开了新的突变人细胞因子及其融合蛋白在治疗代谢疾病中的作用，本发明提供的哺乳动物细胞表达突变的人细胞因子为序列表SEQ ID NO:3所示的蛋白质。本发明对野生型人细胞因子基因进行突变和N端改造，所述的融合蛋白含有人细胞因子突变体和人IgG4的Fc段（CH₂‑CH₃）。本发明提供的哺乳动物细胞表达重组细胞因子融合蛋白具有良好的降血糖活性，特别是所述融合蛋白，还具有稳定性高、半衰期长等优点。并且本发明提供的融合蛋白还能较好的控制血糖的波动，稳定维持24小时血糖处于正常水平。

技术领域

本发明涉及突变的细胞因子，尤其涉及突变的人源细胞因子，本发明还涉及该突变的人源细胞因子在制备治疗代谢疾病药物中的用途，属于突变细胞因子领域。

背景技术

糖尿病是危及全球的一种严重的代谢疾病，目前我国糖尿病患者已达4000万左右，患病率已由十几年前的1%增长至目前的2.5%，并以每年1‰的速度递增。糖尿病已经成为继心脑血管疾病和癌症之后威胁人类健康的第三大杀手。

目前仍缺少治愈糖尿病的方法，临床上对糖尿病以药物控制为主，患者需要终身服药以达到控制血糖水平，减轻糖尿病的症状，延缓并发症的出现的目的。现临床应用的糖尿病药物极易引起一些较严重的副作用，如低血糖、体重增加、心血管毒等副作用。而且由于糖尿病后期多数患者体内胰岛素抵抗现象严重，导致大部分依赖胰岛素通路的药物失效，给糖尿病治疗带来较大困难。因此，探寻更有效，安全的，尤其是可不依赖胰岛素途径独立调节血糖的新型药物一直是糖尿病的治疗研究中现实而紧迫的任务。

成纤维细胞生长因子-21是2000年发现的FGF家族一员，主要在肝脏中表达。经研究发现，FGF21能够高效并持续调节机体糖脂代谢，刺激脂肪细胞的葡萄糖吸收，降低ob /ob和db /db小鼠血浆中葡萄糖和甘油三脂的浓度，并且FGF21可以有效降低糖尿病动物胰岛素水平，改善胰岛素抵抗，不依赖胰岛素进行血糖调节，而且也不会导致类似胰岛素等药物大剂量用药造成的低血糖。更为值得我们注意的是它不同于同家族的其它因子，不会引起细胞的增殖。因此，FGF21有望成为治疗2型糖尿病新型潜力药物。

人免疫球蛋白IgG在体内的半衰期为20d，其稳定性是由于IgG的Fc片段与新生Fc受体（FcRn）结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。

蛋白稳定性的高低直接影响其在宿主细胞中的表达量，为了提高产量，并在不影响蛋白原有活性的基础上，需要将FGF21进行适当的突变，通过与人IgG4的Fc片段连接成融合蛋白的形式来提高FGF21的稳定性，这将加快FGF21的中试生产，对临床具有非常重要的意义。

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell, CHO cell）属于高等哺乳动物成纤维细胞，是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。与原核及酵母等表达系统相比，CHO细胞所具有的优点包括：1）具有准确的翻译后修饰功能，如糖基化、磷酸化、酰基化、二硫键形成等，使其表达的蛋白在分子结构、生物学功能等方面非常接近天然的蛋白；2）具有产物胞外分泌的功能，有利于外源蛋白的分离纯化；3）具有外源基因的高效扩增和表达能力，且基因整合稳定；4）属于半悬浮性细胞，具有贴壁生长特性，耐受剪切力和渗透压的能力较强，亦可进行悬浮的规模性培养，表达水平较高；5）属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源性蛋白，利于外源蛋白纯化。

筛选用表达载体结构优化。由于外源基因导入哺乳动物细胞的效率很低，从整合并表达外源基因的工程细胞中筛选出高表达的细胞克隆是一项很费时费力的工作。首先要依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统。本专利优化的筛选用表达载体pBMN同时整合了谷氨酰胺合成酶（GS）筛选系统。GS筛选系统有以下两个优点：1）有相对较高的外源基因扩增和表达能力。使用GS体系仅需一轮放大，就能筛选到有效的外源基因表达水平，而较DHFR基因扩增系统筛选效率高出一倍。2）谷氨酰胺合成酶是利用氨与谷氨酸合成谷氨酰胺的，此过程缓解了培养过程中氨积累的问题。