[发明专利]一种融合蛋白SACP、编码基因、工程菌及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种蛋白类生物高分子融合(SACP)及其应用。

(二)背景技术

近年来多种性能优异的生物来源多肽、长肽和蛋白质被研究人员所发现。硅沉积肽、钙结合肽段、壳聚糖结合肽段、蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝粘蛋白、节肢动物弹性蛋白以及贝壳粘附蛋白等大量性能优异的新型蛋白类材料受到材料学研究的重视。由于化学合成法的限制，当前蛋白类生物材料研究，多采用先合成小肽，而后通过小肽多级自组装形成较大药物负载复合体的研究思路。基因工程法是进行蛋白质外源表达的常用方法，其所产目标蛋白为单一长度产物，不存在化学合成所带来的副产物，且产物长度可达到数千氨基酸残基，合成能力远超化学合成，同时生产成本也远低于化学合成。因此采用基因工程法制备蛋白类生物材料的最佳选择，当前相关研究还较少。

本发明选取具有pH响应自组装性能的蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt)，具有高弹性能的果蝇弹性蛋白(Res)部分序列和具有高粘附性能的贻贝黏附蛋白(Ma)部分序列为目标功能肽段，借助基因融合技术，形成由蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt1)、果蝇弹性蛋白(Res1)、贻贝粘附蛋白(Ma1)、果蝇弹性蛋白(Res2)、贻贝粘附蛋白(Ma2)、果蝇弹性蛋白(Res3)和蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt2)等7个嵌段顺次连接构成的新型生物高分子SACP，其长度为964个氨基酸残基。SACP为人工将3个远源物种(蜘蛛、果蝇和贻贝)来源的功能肽段融合形成的全新生物高分子。由于自然生殖隔离的存在，没有理论支持本发明SACP蛋白可能存在于任何已知生物体中的可能性。该7嵌段SACP具有优异的粘附性能、弹性和pH响应自组装性能，可体外形成形式多样的生物医用材料，在诸多生物医用领域，尤其是医学缝合和伤口外敷方面具有突出的应用潜力，在生物医药领域具有广阔的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种性能优异的生物医用高分子，具体为蛋白类生物高分子-融合蛋白(SACP)，以及其在制备医学缝合和伤口外敷药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种融合蛋白SACP，所述融合蛋白SACP为人工设计制备的跨物种融合蛋白，来源物种为蜘蛛、果蝇和贻贝，具体本发明所述SACP蛋白是由蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt1)、果蝇弹性蛋白(Res1)、贻贝粘附蛋白(Ma1)、果蝇弹性蛋白(Res2)、贻贝粘附蛋白(Ma2)、果蝇弹性蛋白(Res3)和蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt2)共7个嵌段顺次连接构成，长度为964个氨基酸残基，所述SACP蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明由于蜘蛛、果蝇和贻贝间存在自然条件下不可能逾越的生殖隔离，因此没有理论依据支持可能存在天然的本发明所述融合蛋白SACP。

本发明还提供一种所述融合蛋白SACP的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述融合蛋白SACP的编码基因序列为非天然基因序列，是经过密码子改造并由人工合成的全新基因序列。由于构成融合蛋白SACP的7个天然肽段存在大量大肠杆菌稀有密码子，且具有较高的甘氨酸和丙氨酸比例，不适合直接在大肠杆菌中表达。因此，本发明对融合蛋白SACP的基因密码子进行了优化，移除了所有稀有密码子，并对甘氨酸和丙氨酸密码子进行了均衡分配，最后通过全基因合成法获得新型人造蛋白类高分子融合蛋白SACP的基因。同样由于生殖隔离的存在，没有理论依据支持可能存在天然的本发明所述编码SACP的基因。

本发明涉及一种由所述编码基因构建的重组载体，所述融合蛋白SACP表达载体的构建方法为：将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列插入质粒PUC57的EcoRⅤ位点，表达元件为Lac启动子、Lac操纵子、Lac核糖体结合位点(RBS)和T7终止子，全表达框长度为3182bp，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

本发明涉及一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的构建方法为：将SEQ ID NO.3所示核苷酸序列导入宿主菌内(优选大肠杆菌DH5α菌株)，经表达纯化，获得重组基因工程菌。