[发明专利]一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的研制方法

权利要求书

1.一种性腺组织特异性调控表达载体，其特征在于：所述载体是采用观赏鱼性腺特异性启动子kop或vasa或UTR调控序列nanos1 3'UTR调节Tet-on系统的rtTA的表达，表达的rtTA与四环素结合后，驱动TRE启动子启动下游Cre蛋白表达的质粒载体；所述性腺组织特异性调控表达载体命名为pISceI-LoxP-Q.rtTA-TRE.Cre，所述Q是kop或vasa或nanos1 3'UTR调控序列。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：命名为pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre，序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的性腺组织特异性调控表达载体在培育性腺组织特异调控表达转基因观赏鱼品系或生态安全型转基因荧光观赏鱼中的应用。

4.权利要求1所述的性腺组织特异性调控表达载体的构建方法，其特征在于：是将性腺特异性启动子kop或vasa或调控序列nanos1 3'UTR串联Tet-on系统的rtTA以及TRE启动子和Cre后导入pISceI-LoxP-CMV-eGFP载体中，替换载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP两个LoxP位点之间的元件，构建出性腺组织特异启动子kop或vasa或调控序列nanos1 3'UTR调控下的tet-on表达系统。

5.利用权利要求1或2所述的性腺组织特异性调控表达载体实现性腺组织特异调控表达转基因观赏鱼品系的培育方法，其特征在于：采用显微注射法，将所述性腺组织特异性调控表达载体与I-SceI酶注射入观赏鱼单细胞受精卵，筛选得到性腺组织特异调控表达转基因观赏鱼品系。

6.生态安全型转基因荧光观赏鱼的培育方法，其特征在于：将荧光蛋白表达转基因观赏鱼品系与权利要求5得到的任一组织特异调控表达转基因观赏鱼品系杂交，产生鱼卵用9μ g /mL Dox浸泡处理24 h，收集后于28℃恒定水温中进行培育至性成熟，得到性腺无转基因成分的生态安全型转基因荧光观赏鱼；

所述荧光蛋白表达转基因观赏鱼品系是采用显微注射法，分别将观赏鱼荧光蛋白表达载体与I-SceI酶注射入观赏鱼单细胞受精卵，选育得到表达荧光蛋白转基因观赏鱼品系；

所述观赏鱼荧光蛋白表达载体是以全身性表达启动子CMV或PGK或SV40，驱动荧光蛋白eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的任一表达，并且两端带有巨核酸酶I-SceI识别位点和LoxP位点的质粒载体。

7.根据权利要求6所述的生态安全型转基因荧光观赏鱼的培育方法，其特征在于：所述观赏鱼荧光蛋白表达载体是：荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP序列如SEQ IDNO.1所示；或荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP序列如SEQ ID NO.2所示；或荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-mCherry序列如SEQ ID NO.3所示。