[发明专利]一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的研制方法

说明书

本发明公开了荧光蛋白表达载体，利用能在全身普遍表达的启动子CMV驱动荧光蛋白在观赏鱼体内的表达，实现观赏鱼通体表达功能的荧光蛋白载体。荧光蛋白表达载体的构建方法及应用方法。本发明还公开了一种性腺组织特异性调控表达载体，是性腺特异性启动子kop驱动rtTA的表达，rtTA与四环素结合后，驱动TRE启动子启动下游Cre蛋白表达的质粒载体。该性腺组织特异性调控表达载体的构建方法及应用方法。本发明同时公开一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的培育方法，培养得到的转基因观赏鱼经鉴定后确定为性腺无转基因成分。

技术领域

本发明涉及基因重组载体、构建方法、应用。特别是一种荧光蛋白表达载体与一种性腺组织特异性调控表达载体，以及载体在培育生态安全型转基因荧光观赏鱼中的应用。属于基因工程、观赏鱼分子育种领域。

背景技术

如今养殖荧光观赏鱼在全球范围内形成了规模巨大的产业市场。荧光观赏鱼有别于传统意义的观赏鱼类，其是在一定波长光线照射的情况下，通过自身携带的荧光蛋白发出不同荧光的人工培育观赏鱼品种。荧光观赏鱼具有更高的观赏价值与试验研究价值。例如全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼品系应用于斑马鱼原肾功能的研究，利用绿色荧光蛋白在活体鱼中的表达可以随时观察在任何时期的原肾绿色荧光蛋白表达特征，可以满足对斑马鱼原肾功能研究的整体性与完整性要求。

在荧光观赏鱼研究上，美国最早实现商业化生产。其GloFish荧光斑马鱼在美国境内(除了加州外)已经上市。几乎同时，台湾台港科技推出了TK系列荧光观赏斑马鱼和青鳉鱼。目前的荧光观赏鱼由于性腺中存在转基因成分，观赏鱼后代可以繁育并传递转基因元件，因此存在着一定的生态风险问题。

发明内容

本发明的目的是利用转基因分子动物育种技术构建表达不同荧光蛋白的载体，同时构建出性腺组织特异性调控表达载体。并将两种表达载体应用于培育转基因荧光观赏鱼品系。进而，对所获得的转基因荧光观赏鱼品系进行诱导处理，除去荧光鱼性腺中的转基因成分，以达到观赏鱼后代回归野生型的目的，保证生态安全。

为实现上述目的，本发明分别提供一种荧光蛋白表达载体及其构建方法，该表达载体在培育转基因观赏鱼品系中的应用；一种性腺组织特异性调控表达载体及其构建方法，该表达载体在培育转基因观赏鱼品系中的应用；两种载体在培育生态安全型转基因荧光观赏鱼中的应用。各技术方案分别如下：

一种荧光蛋白表达载体，其特征在于：是以全身性表达启动子CMV或PGK或SV40，驱动荧光蛋白eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的任一表达，并且两端带有转座子I-SceI和LoxP位点的质粒载体；荧光蛋白表达载体名称为pISceI-LoxP-CMV-R，其中R是荧光蛋白eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的任一。

上述荧光蛋白表达载体中，荧光蛋白衍生物是不同颜色荧光蛋白经碱基突变修饰后，改良荧光性能的一类衍生物质，采用FP表示。

在优先条件下，上述荧光蛋白表达载体的全身性表达启动子是CMV；上述荧光蛋白表达载体的荧光蛋白是eCFP或eGFP或mCherry，分别是蓝色荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP、绿色荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP、红色荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-mCherry。三种马鱼荧光蛋白表达载体序列分别是：

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP序列如SEQ ID NO.1；

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP序列如SEQ ID NO.2；

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-mCherry序列如SEQ ID NO.3。