[发明专利]一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及电化学免疫传感技术领域，特别是涉及一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料制备一种检测癌胚抗原的电化学免疫传感器。

背景技术

癌胚抗原(CEA)是一个广谱性肿瘤标志物，能反映出多种肿瘤的存在，扮演角色为功能性结肠癌配体，在大肠癌、乳腺癌和肺癌的辅助诊断，疗效评价、病情控制和发展、监测复发方面是一个较好的肿瘤标志物。目前测定CEA的免疫方法主要有酶联免疫分析，荧光免疫分析，放射免疫分析等。这些方法灵敏可靠的优点。但是存在一定的缺陷，如酶联免疫分析和荧光免疫分析成本较高，并且存在试剂盒难以保存的问题，而放射性免疫分析的重现性较差，有辐射危害。电化学免疫传感器由于所需仪器设备简单，操作简便，灵敏度高，选择，成本低等优点受到了广泛关注。目前在疾病诊断领域面临的主要挑战是如何发展微型化、集成化和便携化的监测分析手段和设，建立一套简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的方法。因此本发明制备了一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器，将免疫学方法与电化学方法相结合，以K₃Fe(CN)₆为电化学探针，通过抗原抗体之间高度的特异性结合实现对CEA的检测。

本发明AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料，在此，PDDA作为导电聚合物一方面可以增加电极的导电性，另一方面可以改变石墨烯的表面性能阻止石墨烯团聚。PDDA和石墨烯的协同效应可以使修饰电极具有更大有效面积，为AuNPs提供更多的依附位点，而AuNPs的量又能直接影响抗体在电极上的负载量。实验中采用PDDA-GN和AuNPs也将提高修饰电极的电子转移途径和生物兼容性。在本发明构建的电化学免疫传感成本低，稳定性好，制备过程简单，灵敏度高。

发明内容

本发明的目的之一是基于AuNPs-PDDA-GR复合材料为基底材料，构建了一种无酶，无标记，稳定性好，灵敏度高的电化学免疫传感器；

本发明的目的之二是采用K₃Fe(CN)₆为电化学探针，通过抗原抗体之间高度的特异性结合实现对CEA的检测。

本发明的技术方案为：

1.一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：

(1)用1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al₂O₃抛光粉依次打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干，取6~10μLAuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNPs-PDDA-GR得到AuNPs-PDDA-GR/GCE；

(2)取50μL1.0~2.5μg/mL的癌胚抗原抗体(anti-CEA)标准溶液滴涂到电极表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；

(3)取50μL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE；

(4)滴加50μL浓度为0.1pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器(CEA/BSA/anti-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。

2.上述的AuNPs-PDDA-GR分散液的制备：

(1)PDDA-GR的制备

称取50mg的氧化石墨烯(GO)溶于100mL超纯水中，超声2h得到均一分散的溶液，然后向该溶液中加入0.5mL质量分数为20%的PDDA溶液，搅拌30min。再向该溶液中加入0.5mL80%的水合肼，90℃油浴搅拌24h，得到PDDA-GR黑色悬浊液。离心洗涤至中性后重新分散到超纯水中得到PDDA-GR溶液；

(2)金纳米溶液(AuNPs)的制备