[发明专利]肝癌中环状RNA-MET基因及其制备方法和荧光定量PCR检测方法有效

专利信息
申请号: 201510466685.3 申请日: 2015-07-30
公开(公告)号: CN105018495B 公开(公告)日: 2016-10-26
发明(设计)人: 缪辉来;张茂雷 申请(专利权)人: 广州吉赛生物科技有限公司;广东医学院附属医院
主分类号: C12N15/113 分类号: C12N15/113;C07K7/64;C12N15/10;C12Q1/68
代理公司: 广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙) 44288 代理人: 蔡德晟
地址: 510000 广东省广州市科学*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 肝癌 环状 rna met 基因 及其 制备 方法 荧光 定量 pcr 检测
【权利要求书】:

1.肝癌中环状RNA-MET基因,其特征在于,该肝癌中环状RNA-MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的肝癌中环状RNA-MET基因,其特征在于,PCR扩增所述肝癌中环状RNA-MET基因的引物为:

上游引物:5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'

下游引物:5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'。

3.肝癌中环状RNA-MET蛋白,其特征在于,该肝癌中环状RNA-MET蛋白结构为SEQ ID NO:1所示的1214个核苷酸首尾相接形成环状的分子。

4.如权利要求1所述的肝癌中环状RNA-MET基因的表达方法,其特征在于,该表达方法包括以下步骤:

1)提取总RNA:提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA;

2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA:在上述提取的总RNA中加入反应液,经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA;

3)将RNA逆转录成cDNA:在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物,在PCR体系中逆转录成cDNA;

4)引物设计及PCR扩增克隆测序:设计PCR扩增引物,引物序列为MET-F:5'CCAGATTCTGC CGAACCAA TG 3',MET-R1:5'GCTCCTCTGCA CCAAGGTAA 3';选取β-actin基因为内参基因,作为荧光定量结果数据的矫正基因,序列如下:β-actin F:5'GC ATGGGTCA GAAGGATTCCT 3',β-actin R:5'TCGTCCCAGTTGGTGACGA T 3';然后用PCR扩增环状RNA-MET,电泳检测PCR产物,将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中,然后DNA测序鉴定;用上述引物进行PCR反应,反应完取PCR产物电泳;将PCR产物切胶回收,使用胶回收试剂盒回收纯化,然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中,再将产物转化到DH5a大肠杆菌,过夜培养;第二天挑取单克隆做DNA测序鉴定,PCR产物克隆测序显示RNA-MET的第二个外显子1214bp通过首尾相连发生了环化,即cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的环状RNA-MET基因。

5.根据权利要求4所述的表达方法,其特征在于,步骤1)中具体按照以下步骤提取总RNA:

(a)肝癌组织取2mg大小的组织块,组织用液氮研磨至粉碎,转移到1.5ml离心管,加入1ml trizol;肝癌细胞取100万个左右的细胞,加入1ml trizol;

(b)加入200μL氯仿,剧烈振荡15秒,室温静置15min;

(c)4℃下,12,000g离心15min,溶液分为三层,RNA溶解在水相中,转移水相至另一个新的RNase free EP管;

(d)加入1倍体积异丙醇,涡旋充分混匀;

(e)4℃下,12,000g离心10min,离心后管底出现RNA沉淀,弃去上清;

(f)加入1ml 75%乙醇,用手轻轻颠倒,12,000g离心5min,弃去上清;

(g)室温晾干,加入20μL DEPC水溶解沉淀。

6.根据权利要求4所述的表达方法,其特征在于,步骤2)中的反应液总体积为20μL,由如下组分组成:

步骤1)提取的提取的总RNA在上述反应液中于37℃消化30min后,加入0.5μl EDTA,65℃灭活10min。

7.根据权利要求4所述的表达方法,其特征在于,步骤3)中逆转录的PCR体系为:

反应条件为:25℃5min,42℃20min,85℃5min,4℃2min。

8.根据权利要求4所述的表达方法,其特征在于,步骤4)中PCR扩增环状RNA-MET反应体系为:2×PCR MIX 15μL,10mM上下游引物各1.5μL,HepG2肝癌细胞cDNA模板1μL,用灭菌水补足30μL体系;反应条件为:95℃5min预变性,循环内95℃15s变性,60℃30s退火,72℃延伸30s,共35个循环,PCR反应循环后72℃继续延伸7min,然后16℃保存。

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