[发明专利]肝癌中环状RNA-MET基因及其制备方法和荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.肝癌中环状RNA-MET基因，其特征在于，该肝癌中环状RNA-MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的肝癌中环状RNA-MET基因，其特征在于，PCR扩增所述肝癌中环状RNA-MET基因的引物为：

上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'

下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'。

3.肝癌中环状RNA-MET蛋白，其特征在于，该肝癌中环状RNA-MET蛋白结构为SEQ ID NO:1所示的1214个核苷酸首尾相接形成环状的分子。

4.如权利要求1所述的肝癌中环状RNA-MET基因的表达方法，其特征在于，该表达方法包括以下步骤：

1）提取总RNA：提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA；

2）除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；

3）将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；

4）引物设计及PCR扩增克隆测序：设计PCR扩增引物，引物序列为MET-F:5'CCAGATTCTGC CGAACCAA TG 3'，MET-R1:5'GCTCCTCTGCA CCAAGGTAA 3'；选取β-actin基因为内参基因，作为荧光定量结果数据的矫正基因，序列如下：β-actin F:5'GC ATGGGTCA GAAGGATTCCT 3'，β-actin R:5'TCGTCCCAGTTGGTGACGA T 3'；然后用PCR扩增环状RNA-MET，电泳检测PCR产物，将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，然后DNA测序鉴定；用上述引物进行PCR反应，反应完取PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克隆做DNA测序鉴定，PCR产物克隆测序显示RNA-MET的第二个外显子1214bp通过首尾相连发生了环化，即cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的环状RNA-MET基因。

5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤1）中具体按照以下步骤提取总RNA：

（a）肝癌组织取2mg大小的组织块，组织用液氮研磨至粉碎，转移到1.5ml离心管，加入1ml trizol；肝癌细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol；

（b）加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；

（c）4℃下，12,000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；

（d）加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；

（e）4℃下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；

（f）加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

（g）室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。

6.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤2）中的反应液总体积为20μL，由如下组分组成：

步骤1）提取的提取的总RNA在上述反应液中于37℃消化30min后，加入0.5μl EDTA，65℃灭活10min。

7.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤3）中逆转录的PCR体系为：

反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。

8.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤4）中PCR扩增环状RNA-MET反应体系为：2×PCR MIX 15μL，10mM上下游引物各1.5μL，HepG2肝癌细胞cDNA模板1μL，用灭菌水补足30μL体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃15s变性，60℃30s退火，72℃延伸30s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存。