[发明专利]肝癌中环状RNA-MET基因及其制备方法和荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肝癌中环状RNA-MET基因及其表达方法和荧光定量PCR检测方法；为肝癌的早期诊断和分类提供基础。

背景技术

生物体内的环状RNA(circRNA)是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有明确，目前只有几种假定的说法1)环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能2)circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平3)circRNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性4)circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。

MET基因又叫HGFR(hepatocyte growth factor,HGF),肝脏细胞生长因子受体，其作用是促进肝脏细胞及一些内皮细胞的分裂生长，在肝癌的发生发展过程中具有重要作用。通过环状RNA专门数据库(http://circrna.org/)检索发现MET基因的RNA存在环化现象；然而，目前在这一领域并没有更深入的研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因，从肝癌细胞中PCR扩增环状的RNA-MET，通过克隆测序的方法准确确定了环状RNA-MET环化位点。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

肝癌中环状RNA-MET基因，该肝癌中环状RNA-MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，上述方案中，PCR扩增所述肝癌中环状RNA-MET基因的引物为：

上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'

下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'。

肝癌中环状RNA-MET蛋白，该肝癌中环状RNA-MET蛋白结构为SEQ ID NO:1所示的1214个核苷酸首尾相接形成环状的分子。

本发明的另一目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因的表达方法，通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法测定出来了环状RNA-MET的准确的环化位点；确定了MET基因客观存在一种由1214个核苷酸组成的环状RNA。具体方案如下：

肝癌中环状RNA-MET基因的表达方法，该表达方法包括以下步骤：

1)提取细胞或组织中的总RNA：提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA；

2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；

3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；

4)引物设计及PCR扩增克隆测序

设计PCR扩增引物，引物序列为MET-F:5'CCAGATTCTGC CGAACCAA TG 3'，MET-R1:5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA3'；选取β-actin基因为内参基因，作为荧光定量结果数据的矫正基因，序列如下：β-actin F:5'GC ATGGGTCA GAAGGATTCCT 3'，β-actin R:5'TCGTCCCAGTTGGTGACGA T 3'；然后用PCR扩增环状RNA-MET，电泳检测PCR产物，将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，然后DNA测序鉴定；用上述引物进行PCR反应，反应完取PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克隆做DNA测序鉴定，PCR产物克隆测序显示RNA-MET的第二个外显子1214bp通过首尾相连发生了环化，即cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的环状RNA-MET基因。

进一步的，上述表达方法所述的步骤1)中具体按照以下步骤提取总RNA：