[发明专利]SSR引物组及利用该引物组构建麦芽指纹图谱的方法

权利要求书

1.利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：

包括以下步骤：(1)提取供试样品的DNA；(2)用3条引物PCR扩增：第1条引物为TP-M13引物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是5'端标记荧光的M13通用引物；所述M13通用引物的引物序列为TGTAAAACGACGGCCAGT；(3)毛细管电泳荧光检测；(4)数据分析和图谱构建；

其中，所述SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物；所述4对核心SSR引物序列如下：

麦芽包括以下20种麦芽：

2.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

3.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述PCR扩增体系反应体积为20μL，含MgCl₂ 2.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，带有M13尾巴序列的特异正向引物0.04μmol/L，反向引物0.16μmol/L，M13荧光引物0.12μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5单位，2×PCR缓冲液，所述缓冲液中不含Mg²⁺，样品DNA10-50ng。

4.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述步骤(3)包括以下几个步骤：

a、制备SLS/DSS混合液:取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液,在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；

b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物,加一滴石蜡油覆盖样品；

c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；

d、将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。

5.根据权利要求4所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述步骤(4)数据分析和图谱构建为：对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，得出不同品种麦芽的SSR标记片段；将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小，从而构建麦芽品种指纹图谱。

6.根据权利要求1所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：所述第3条引物是5'端标记有Alexa Fluor 680荧光的M13通用引物。

7.一种利用权利要求1所述的方法进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：将待测样品每粒麦芽DNA的4对SSR引物扩增的电泳图谱分别与麦芽标准指纹图谱相比较，如果待测麦芽的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱数据一致，可判定二者为相同品种；如果待测麦芽的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱的数据有差异，则判定二者为不同的麦芽品种。