[发明专利]SSR引物组及利用该引物组构建麦芽指纹图谱的方法

说明书

技术领域

本发明创造属于生物技术领域，具体涉及一种构建麦芽指纹图谱的方法，尤其涉及一种利用SSR引物构建麦芽指纹图谱，进而进行麦芽品种鉴定的方法。

背景技术

啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。麦芽作为啤酒的主要原料，是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的，麦芽的质量直接决定啤酒的质量。麦芽的品种鉴定是评价大麦质量和麦芽质量最重要的指标，二者均是保证啤酒品质的重要指标。由于缺乏麦芽品种鉴定的技术手段，啤酒企业在麦芽采购时不仅蒙受巨大的经济损失，而且掺假的麦芽由于均一性差，将直接影响糖化、过滤和酿造性能，降低啤酒品质，最终影响啤酒企业的品牌形象。因此啤酒行业内急需开发一种麦芽品种的鉴定技术，进而从源头上保障啤酒原料的品质。

近年来以微卫星(SSR)分子标记为基础的大麦、小麦等农作物DNA指纹库的构建已逐步开展，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)技术在大麦遗传多样性及纯度鉴定等方面的研究也有相关报道。传统的SSR操作通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)配合银染分析进行基因多态性分析，方法成熟，却耗时、耗力、非自动化，尤其是进行大规模、多批次的数据收集和分析时，该方法存在相当大的难度：(1)不能准确读出扩增片段大小；(2)不同等位基因的变异难以准确识别；(3)不同批次反应数据难以统一处理。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电泳具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动化、样品少、应用范围广等优点。毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳在检测时要求引物必须携带荧光检测器能识别的荧光染料，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小。发明专利ZL201310119954.X公开了“一种小麦SSR指纹图谱构建方法”。所述小麦SSR指纹图谱构建方法包括如下步骤：首先提取供试品种的DNA，然后用13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增；PCR产物经五色荧光毛细管电泳检测构建小麦品种的SSR指纹图谱。该方法提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。然而，与普通引物仅30-50元的成本相比，目前1OD荧光引物的成本过高，约600-1000元。

TP-M13-SSR技术是基于荧光测序技术的SSR扩增产物检测体系，也是SSR技术与荧光自动测序技术的完美整合。M13荧光引物具有通用性，只需合成一次。如果试验中需要增加新的SSR引物时，只要合成普通引物即可，不用再合成新的荧光引物，因此试验成本大幅降低。因此，TP-M13-SSR技术结合了SSR技术与荧光检测的优点——简便、可靠、低成本。发明专利ZL201310127570.2公开了“一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法”。该本发明所述的构建方法，包括如下步骤：1)提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA；2)以亲本材料筛选SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA 为模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图谱。该发明建立了枣树SSR标记技术体系，获得的SSR标记和核心引物组，具有高效性、稳定性和共显性等优点。但目前还未见关于应用基于毛细管电泳技术的SSR分子标记进行麦芽品种鉴定的报道。

发明内容

针对目前麦芽品种鉴定缺少成本低、灵敏、准确定量检测手段的问题，本发明提供了SSR 引物组以及利用所述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，该方法基于TP-M13-SSR标记结合毛细管电泳技术，并利用所构建的SSR指纹图谱进行麦芽品种鉴定。

本发明的技术方案是：

SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和 EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物。所述4对核心SSR引物序列如下：

利用上述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：

(1)提取供试样品的DNA：