[发明专利]能够鉴定苏御糯的ISSR‑SCAR标记及其筛选方法

权利要求书

1.能够在苏御糯中扩增得到的特异性片段，其特征在于该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2 所述。

2.一组能够鉴别苏御糯的SCAR 引物，其特征在于该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3 和SEQ ID NO: 4 所述。

3.一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

（1）采用32 条ISSR 引物对12 个水稻品种进行扩增，得到1 条苏御糯特异性片段，能在苏御糯中扩增出特异性条带的引物序列如SEQ ID NO: 1 所述；

（2）将步骤（1）中的特异性片段进行切胶回收并测序，苏御糯中特异性片段的序列如SEQ ID NO: 2 所述；

（3）针对步骤（2）中的序列设计序列特异性引物，特异性引物的序列如SEQ ID NO: 3 和SEQ ID NO: 4 所述；

（4）用步骤（3）中的引物在所有水稻品种中进行单株验证；

（5）用步骤（3）中的引物在苏御糯和4 个籼稻中进行扩增并测序，苏御糯和其它4 个籼稻品种的序列分别如SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8 和SEQ ID NO: 9 所述；

（6）针对步骤（5）中的序列设计位点特异性引物，设计的位点特异性引物序列如SEQ ID NO: 10 和SEQ ID NO: 11 所述；

（7）用步骤（6）中的引物在所有水稻品种中进行单株验证，得到仅在苏御糯中能扩增出特异性条带的引物。

4.根据权利要求3 所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（5）中的PCR 扩增的反应体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA 模板（20ng/μL）1.0 μL，2×Reaction Mix（含20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 μM 的dNTPs，溴酚蓝）10.0 μL，引物（10 mM）1.5 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/μl）0.4 μL，双蒸水补齐至20 μL ；94℃，5 min 预变性；94℃变性1min， 53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，40个循环；最后72℃延伸10 min ；PCR 产物经2% 琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳1.5 h 后，用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000 作为DNA marker。

5.根据权利要求3 所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中PCR 验证体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA 模板（20 ng/μl）1.0 μl，2×Reaction Mix（含20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 μM 的dNTPs，溴酚蓝）10.0 μL，引物（10 mM）各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/μL）0.4 μL，最后用双蒸水补齐至20 μL ；扩增程序为：94℃，5 min 预变性；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸5 min ；PCR 扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳0.5 h 后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000 作为DNA marker。

6.根据权利要求3 所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤（7）中PCR 验证体系同步骤（1）相同，不同在于退火温度为60℃。