[发明专利]一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法。

背景技术

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是上世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好和易自动化等特点，目前已成为生物学研究领域不可或缺的研究方法。在水产鱼类生物学研究中，PCR方法是进行核酸检测的首选方法。在进行PCR之前，需要有一条含有目的基因片段的DNA链作为模板。

目前，鱼类模板DNA的提取操作较为复杂，操作过程中对温度控制要求较高，人工劳动强度较大，不便推广使用。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法。

本发明所采用的技术方案为，一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，包括以下步骤：

1)样本预处理：将鱼卵或仔鱼捣碎；

2)加裂解液：向体系中加入DNA裂解液；

3)消化：将整个体系依次在53～57℃消化80～100min，93～97℃变性3～8min，4～8℃保持3～8min。

在消化完成后，即可得到鱼类PCR模板DNA，在-20℃冷藏即可。

在需要使用时，先将体系解冻，再向其中加入等体积氯仿，离心后取上层清液即可使用。

优选的，所述裂解液的成分及含量如下：10mmol/L的Tris-Cl、1mmol/L的EDTA、质量分数为0.5％的SDS、20mg/mL的ProteinaseK，余量为纯水。本发明中，所述裂解液的pH值为8.0。

当然，裂解液的组成配方不局限于这一种，本行业技术人员可根据现有技术，选择合适的、不同组成的裂解液。同时，对于消化温度和时间的设置，因为都属于现有技术，本行业技术人员可以轻易得到和调整，在此就不再赘述。

优选的，在所述步骤1)样本预处理前，还包括样本的固定：将所述样本浸泡于无水乙醇中，在-20～25℃下保藏待用。使用无水乙醇可保证DNA分子在一定的时间内不降解，利于后续DNA的提取流程。

进一步的，所述样本与所述无水乙醇的体积比为1:5～1:10。根据不同的鱼类样本，可调整不同的体积比以满足后续提取流程，当然，绝大多数样本和无水乙醇的最适体积比均落于1:5～1:10之内。

需要说明的是，在所述样本的固定和所述步骤1)之间，还包括固定液的去除：将所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保无水乙醇去除干净；除去固定液是为了避免无水乙醇对后续提取流程的影响。

为了在PCR模板DNA提取的过程中，精确、简单的控制温度，本发明创造性的在3)消化过程中，使用PCR仪进行温度控制。也就是说，使用PCR板作为样本的承载物，且在向PCR板中加入样本和裂解液后，用PCR封板膜密封，在PCR仪内进行3)消化。

需要说明的是，PCR板每一个孔中，所述样本的数目一般情况下是一个，也就是说，只使用单个鱼卵或是单尾仔鱼，采用一个样本的设置，最终得到的PCR模板DNA也是一套，不会出现某个DNA链基因重复出现的情况。对应单个鱼卵或是单尾仔鱼，裂解液的量为50～100μL。

PCR仪对于温度的控制简单而精确，无需使用传统的水浴控温手段，简化了操作强度的同时，提高了提取过程中的精度。

优选的，在3)消化完成之后，还包括PCR模板DNA的检测。所述检测为：使用所述PCR模板DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增结果进行电泳分析。本发明直接使用PCR扩增技术对所述PCR模板DNA进行检测，在一般的实验条件下，直接考量PCR扩增得到的目的基因，根据目的基因的数目和均一度，判断所述PCR模板DNA的提取是否成功。

进一步的，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；然后25个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；25个循环完毕后，最后72℃延伸10min。作为本技术领域的常用选择，所述电泳分析为8％聚丙烯凝胶电泳检测。

本发明的有益效果为：

1、本发明使用PCR仪进行温度控制，PCR仪对于温度的控制简单而精确，无需使用传统的水浴控温手段，简化了操作强度的同时，提高了提取过程中的精度。

2、本发明操作流程简单，步骤少，提取速度快，具有快速简洁的优点。