[发明专利]一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；

(2)以1％～10％的体积百分比，将种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO₂浓度为5μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；

(3)以5％～15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO₂浓度为10μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的菌体；

(5)在步骤(4)的菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，使菌体浓度为150mg/mL～400mg/mL，加入溶菌酶，混匀后破壁1h～3h，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液；所述电子供体粗蛋白液还经过如下分离纯化步骤：

(a)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20-30％，缓慢添加并搅拌，于0-4℃冰箱放置2-4h、离心后，收集沉淀溶于HEPES缓冲液；

(b)经硫酸铵沉淀后的电子供体粗蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全；

(c)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶过滤层析中的一种或两种层析，制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述电子供体蛋白缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为2μg/mL～10μg/mL和2.0μmol/mL～20.0μmol/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述溶菌酶的浓度为10mg/mL～50mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus 6013。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，

步骤(c)所述层析是将透析后的蛋白液上样量为20-40mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0.5-1.0M的NaCl的100-200mL的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的电子供体蛋白上样于经HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱；用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，制得纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白液。

6.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，

所述离心条件为7000-9000r/min下离心10-20min；

所述阴离子交换层析HEPES缓冲液浓度为20mM～80mM，pH为7.0～8.6。