[发明专利]一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用，具体步骤为：(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种培养后，制成种子液，并接种至诱导培养基A中，静止诱导培养，得诱导工作发酵剂；(2)将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，静止诱导培养，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；(3)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，清洗后离心，得菌体；(4)在菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，加入溶菌酶，混匀后破壁，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。粗蛋白液经纯化得到电子供体蛋白。所述电子供体蛋白与亚硝酸盐还原酶的混合液可快速高效降解亚硝酸盐。

技术领域

本发明涉及生物制品领域，为一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus 6013(简称为LCR 6013)中降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法。

背景技术

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的食品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染，肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，水产养殖水体亚硝酸盐超标导致潜在食品安全问题等一系列的问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的微生物外，还可利用亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase，简称为NiR)进行亚硝酸盐的生物降解。但是NiR是一种氧化还原酶，反应过程中需要电子传递体的参与，而且受氧气的抑制。现在公认的反硝化过程分为4步，分别由不同的还原酶催化。其中NO₂^-转变成NO由亚硝酸还原酶(NiRs)所催化，其催化反应为：NO₂^-+e^-+2H⁺→NO+H₂O，是反硝化作用区别于其它硝酸盐代谢的标志性反应，在反硝化过程中扮演了重要角色。NiRs分布于细胞壁与细胞膜之间，根据其辅基的不同分为血红素cd 1型亚硝酸还原酶(cd 1-NiRs)和铜型亚硝酸还原酶(Cu-NiRs)两种类型，它们分别以血红素cd 1和Cu作为辅基，每种反硝化细菌具有两种不同形式NiRs中的一种。

微生物降解亚硝酸盐是最常用的方法，主要有乳酸菌属和假单胞菌属。由于假单胞菌可能有毒性，不适合于食品中降亚硝酸盐，从食用安全的乳酸菌干酪乳杆菌中提取亚硝酸盐降解的电子供体蛋白未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，通过层析分离制备纯化亚电子供体蛋白液。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；

(2)以1％～10％的体积百分比，将种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO₂浓度为5μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；

(3)以5％～15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO₂浓度为10μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的菌体；