[发明专利]一种纯化百日咳杆菌Prn蛋白的免疫亲和层析柱及蛋白纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纯化百日咳杆菌Prn蛋白的免疫亲和层析柱及蛋白纯化方法。

背景技术

百日咳是一种由百日咳杆菌感染引起的急性呼吸道传染病，主要感染6岁以下的婴幼儿。对于该病的预防最经济有效的方法为注射疫苗。1914年全细胞百日咳疫苗研制成功，在控制和预防百日咳发病方面发挥的巨大作用，但该疫苗副反应比较大，被一些发达国家抵制。80年代，日本发明了无细胞百日咳疫苗，其去除了引起副反应的毒性物质，保留了起免疫保护作用的抗原性，推动了疫苗学的进展。

无细胞百日咳疫苗的主要有效成分为百日咳毒素（PT）、丝状血凝素（FHA）、粘附素（Prn）、凝集原（AGG）等。在我国疫苗中的成分主要是PT、FHA。

Prn是一种非纤毛性的凝集原，具有较强的免疫原性，在欧美和我国的部分企业已将其作为百日咳疫苗的重要组分。Prn蛋白产量小，对于它的纯化有很多方法。有的利用Affi-gelblue吸附，用高盐洗脱，透析后经层析聚焦。该方法为非特异性吸附，杂蛋白较多，且引入较多盐类。现在大部分企业对于该蛋白先利用硫酸铵多步沉淀，来浓缩目的蛋白，再利用层析柱过滤，用高盐洗脱。该方法步骤繁琐，耗时较多，非特异性吸附，引入杂蛋白污染。

发明内容

本方法针对现有技术在纯化Prn蛋白中存在的缺点，提供一种纯化百日咳杆菌Prn蛋白的免疫亲和层析柱及蛋白纯化方法，是以Prn蛋白作为抗原，免疫兔制备多克隆抗体，通过实验优化，利用多抗制备了纯化Prn蛋白的亲和免疫层析柱，该免疫层析柱可以特异性纯化Prn蛋白，且引入杂质少，为Prn蛋白的纯化提供了新方法。

根据本发明的第一个方面，一种纯化百日咳杆菌Prn蛋白的多克隆抗体，是由百日咳杆菌Prn蛋白经免疫动物后采血，分离抗血清后纯化制得。

所述的动物是兔。

根据本发明的第二个方面，一种纯化百日咳杆菌Prn蛋白的免疫亲和层析柱，是由固相载体和与其偶联的纯化百日咳杆菌Prn蛋白的多克隆抗体组成。

所述固相载体为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。

所述的载体为CNBr活化的Sepharose4B。

根据本发明的第三个方面，纯化百日咳杆菌Prn蛋白的免疫亲和层析柱的制备方法，包括如下步骤：

第1步、Prn蛋白免疫动物后采血，分离抗血清后纯化制得多克隆抗体；

第2步、将载体活化，与多克隆抗体进行偶联，得到免疫亲和层析柱。

根据本发明的第四个方面，一种纯化百日咳杆菌Prn蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

第1步、将百日咳菌株的培养上清液除去FHA与PT蛋白，再送入超滤膜中进行浓缩，再将浓缩液离心，收集上清液；

第2步、将上清液送入所述的纯化百日咳杆菌Prn蛋白的免疫亲和层析柱中，进行上样；

第3步、上样结束后，再用洗脱液进行洗脱，得到纯化蛋白。

所述的第1步中，超滤膜的截留分子量是30kD；在进行离心之前，需要用50mMTris-HCl、pH=7.5溶液进行复溶处理。

所述的第2步中，在将上清液上样前，需要先平衡层析柱，所用的平衡液为50mMTris-HCl、pH=7.5的溶液。

所述的第2步中，上清液的体积是柱体积的4倍。

所述的第3步中，洗脱过程是先用5倍柱体积的50mMTris-HCl、pH为7.5的溶液洗脱杂蛋白，再用50mMTris-HCl、pH为3.5缓冲液，洗脱Prn蛋白。

发明效果：一、本发明应用多抗制备的免疫亲和层析柱可以高效纯化Prn蛋白；二、应用多抗制备的免疫亲和层析柱纯化Prn蛋白，可以缩短操作时间，降低纯化成本，减少引入杂质的污染，纯化蛋白更纯。

附图说明

图1、成年兔免疫Prn蛋白血清抗体检测效价与血清稀释倍数关系图；

图2、纯化后的多克隆抗体SDS-PAGE电泳图；其中，1泳道为样品，2泳道是marker；

图3、对上清中Prn蛋白纯化过程中不同样品的SDS-PAGE电泳图；其中，1泳道为上样前样品，2泳道是过柱流出液，3泳道是洗脱液，4泳道是标准Prn蛋白。

具体实施方式