[发明专利]富集短链核酸的方法

说明书

本发明专利申请是国际申请号为PCT/EP2006/069484，国际申请日为2006年12月08日，进入中国国家阶段的申请号为200680046308.3，名称为“富集短链核酸的方法”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及富集长度小于300个核苷酸的核酸的方法，涉及用于富集长度小于300个核苷酸的核酸的试剂盒，涉及所述试剂盒的用途，涉及阴离子交换基质的用途并涉及治疗疾病的方法。

若干年前，由于发现小的核糖核酸(RNA)执行了基因表达的实质调节功能，因此科学研究日益集中于短于300个核苷酸，尤其是短于100个核苷酸的小RNA。更具体地说，许多研究者已经对微小RNA(miRNA)感兴趣。miRNA是一类在进化上保守的长度约22个核苷酸的小的非编码RNA，其在调节基因表达中的复杂作用正变得越来越明显。已在所研究的所有真核生物和几乎所有组织中发现miRNA，其中包括真菌、植物、昆虫和哺乳动物。除了miRNA，还已经发现其它小RNA在细胞功能中也扮演重要角色。这些小RNA包括，例如，小干扰RNA(siRNA)、核小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。

这些短于300个核苷酸的短RNA必须尽可能纯并以高产率从要研究的生物系统中纯化，这样才能够研究它们的细胞作用。因此迫切需要提供能够从复杂生物系统、尤其从细胞裂解物中纯化和分离这种短RNA的方法。

通常，为分离生物样品中的核酸，必须将它们与剩余的细胞组分如蛋白质、糖类、脂质和其它组分分离。现有技术已经披露了多种从非常不同的原料，如从细胞培养物、从植物和动物来源的组织、以及从体液分离核酸的方法。例如，一种方法包括在有机溶剂如酚和氯仿的帮助下提取通常为水性的原始溶液(Chomczynski和Sacchi，1987)，然后在醇类如乙醇或异丙醇的帮助下从水相中沉淀核酸(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.in T.Maniatis，CSH，Molecular Cloning，1989)。另一种方法包括将核酸固定于固相，例如通过硅吸附技术。不利的是，所有这些方法不能、或不足以分离或至少纯化相对较小的核酸。

为解决该问题，现有技术已经披露了专门富集小RNA群体的方法，该方法基于硅膜技术。在这些方法中，在将细胞裂解之后在细胞裂解物中加入相对小量的醇，在离液结合条件下至少部分相对较长的核酸可结合于硅膜。然而，现有技术所述纯化方法中所用醇的量过低，因此不能使小核酸也有效结合于硅膜，因此这些小RNA出现在流出液中。然后提高流出液的醇浓度，然后再结合第二硅膜。洗涤步骤之后，小RNA与未结合于第一柱的所有其它核酸一起被洗脱(参见，例如，来自美国奥斯汀安拜恩公司(Ambion，Austin，USA)的试剂盒或来自德国希尔登恰根公司(QIAGEN，Hilden，Germany)的脂组织迷你试剂盒，使用方法见使用手册)。

恰根与安拜恩法的缺点在于需要使用两种固相，且通过单次结合步骤无法仅获得所需的小RNA。此外，例如，如果不同时分离tRNA和其它较大核酸，则该方法无法分离大小约22个核苷酸的miRNA。尽管在某些条件下通过该方法可以富集小RNA，尤其是miRNA达到一定程度，但所述小RNA仍会被其它核酸尤其被转运RNA(tRNA)污染。

本发明的目的是克服现有技术的缺点。

更具体地说，本发明的目的是提供一种富集(enrich)小核酸，尤其是miRNA的方法，例如，该方法能够采用尽可能少的方法步骤从复杂的生物组合物如细胞裂解物中富集小核酸。

本发明的再一个目的是提供一种纯化小核酸的方法，例如，该方法不仅能够从复杂生物组合物如细胞裂解物中长度大于300个核苷酸的核酸或其它组分中除去长度为25个核苷酸或更小的特定核酸，还能够从长度小于300且大于25个核苷酸的其它核酸如tRNA中特异性除去这些小核酸。

本发明还提供了一种可用于尽可能单独产生所需大小的RNA的方法。

本发明的再一个目的是提供一种无需改变反应容器的方法－通过“单容器反应(one-pot reaction)”－从而将待分析样品的混合风险降至最低。

本发明的再一个目的是提供一种试剂盒，在该试剂盒的帮助下能够如上所述从复杂生物组合物中有利地纯化小核酸，尤其是小RNA。

一种富集长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸的方法为解决一开始提到的问题做出了贡献，所述方法包括以下步骤：