[发明专利]一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法

权利要求书

1.一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1)根据百日咳腺苷酸环化酶毒素1-373位氨基酸的功能域的编码核苷酸序列来设计引物，在两侧引入酶切位点，PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌；

2)根据人钙调蛋白的编码核苷酸序列来设计引物，在两侧引入酶切位点，PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌；

3)将所述步骤1)和步骤2)中获得的重组大肠杆菌诱导表达，并且破碎收集上清，加入三磷酸腺苷完成酶促反应，经有机溶剂处理后可获得高纯度的环磷酸腺苷；其中步骤1中所述百日咳腺苷酸环化酶毒素的核苷酸序列为GenBank登录号：GQ370813.1所示序列，步骤2中所述人钙调蛋白的编码核苷酸序列为Genbank登录号：BT006818.1所示序列；其中步骤3)中所述有机溶剂为乙醇，经有机溶剂处理为加入有机溶剂至最终浓度为40体积％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，分别接种所述步骤1)和所述步骤2)中的重组大肠杆菌至LB/Amp培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养过夜，然后按1:100的比例转接至5L新鲜LB/Amp培养基中继续培养3h后开始诱导表达，诱导条件为：IPTG浓度1mM，诱导温度37℃，诱导时长5h；将蛋白终浓度为1mg/ml的含有百日咳腺苷酸环化酶毒素的上清25μl、蛋白终浓度为1mg/ml的含有钙调蛋白的上清25μl、浓度为1mg/ml的三磷酸腺苷100μl、2μl 6mM MgCl₂、2μl 0.12mM CaCl₂、46μl 50mM Tris·HCl(pH8.0)在30℃条件下反应10分钟。