[发明专利]一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法

说明书

本发明涉及一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法，该方法包括：在大肠杆菌中分别重组表达百日咳腺苷酸环化酶毒素(Adenylate cyclase toxin，ACT_1‑373)和钙调蛋白(Calmodulin，CALM)。重组菌株经破碎后，分离得到上清，将含有ACT_1‑373和CALM的破碎上清混合，加入三磷酸腺苷(ATP)，在30℃下搅拌10min，完成酶促反应，上清经乙醇处理后可获得高纯度的CAMP。本发明为大量制备CAMP提供了可能。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体的说，本发明涉及酶法催化合成环磷酸腺苷(CAMP)的方法。

背景技术

环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，CAMP)是一种重要的核酸衍生物，具有多种生理功能，在医药和畜牧业领域有广泛的应用。在医药应用中，CAMP是人体细胞内的第二信使，参与调节糖代谢、脂代谢、核酸的合成、蛋白质的合成。研究表明，包括冠心病、心肌梗塞、癌症等40余种疾病的发生都与CAMP的代谢异常有关。外源性的CAMP具有舒张平滑肌、扩张血管、改善心肌缺氧、改善肝功能等生理功能。因此，临床上使用CAMP治疗心绞痛、急性心肌梗死、心源性休克以及呼吸系统疾病、肝胆疾病等(党立，王希敏，韩利文等，山东科学，2007，20(3)：61-64)。此外，CAMP也可以用作中间体，合成脂溶性效果好、药理作用更强、起效更快的二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲酸等药物。在畜牧业领域，CAMP可以作为饲料添加剂，模拟生长激素的作用，促进畜禽的生长增重，增强畜禽的体质，提高抗病、抗寒能力，增加优质畜禽产品的产量。

大部分国内企业使用化学法生产CAMP，合成方法包括碱水解法、DCC脱水法、活性脂法、三氯氧磷法等。少数企业从大枣等天然产物中提取CAMP。但是，现有的化学合成法成本高、污染严重、原料毒性大。而从天然产物中提取的工艺复杂，获得的CAMP纯度低，一般仅作为保健品使用。这些不足限制了CAMP的大规模生产和广泛应用。基于这一现状，亟需开发高效、无污染且适合产业化的新型CAMP生产方法。发酵法和酶法因为其环境友好的特点越来越受到重视。发酵法是通过筛选和培养产CAMP的菌株或者构建表达腺苷酸环化酶的重组菌株实现在细胞水平催化生产CAMP。如发明专利CN 102433292公布了一种利用基因重组大肠杆菌催化生成CAMP的方法。发明专利CN 102899372公布了一株高产CAMP节杆菌及其发酵方法，该方法获得CAMP的产量为7.52g/L。发明专利CN 104342468公开了腺苷酸环化酶基因克隆入枯草芽孢杆菌获得一株基因工程菌，通过培养最高可以获得12.1g/L CAMP的发酵水平。但是，现有的发酵法所用菌株的发酵水平较低，还无法满足大规模工业生产的要求。酶法是通过使用腺苷酸环化酶催化ATP生成CAMP。与发酵法相比，酶法同样具有条件温和、无污染等特点。酶法的优点在于反应的产物更加专一，过程易于控制，反应体系中不含有微生物、有毒的原料试剂等杂质，非常有利于后续的分离纯化。目前，酶法生产CAMP的报道较少，原因在于酶的制备复杂。因此，有必要开发出高效的腺苷酸环化酶制备方法、简单的酶促反应体系，突破这一瓶颈。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷来发明一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法，该方法包括下列步骤：

1)获得表达腺苷酸环化酶的重组大肠杆菌；

2)获得表达钙调蛋白的重组大肠杆菌；

3)将所述步骤1)和步骤2)中获得的重组大肠杆菌诱导表达，并且破碎收集上清，加入三磷酸腺苷完成酶促反应，经有机溶剂处理后可获得高纯度的环磷酸腺苷。

优选地，在所述步骤1)中，根据百日咳腺苷酸环化酶毒素1-373位氨基酸的功能域的编码核苷酸序列来设计引物，在两侧引入酶切位点，PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌。